Cercetătorii îmbunătățesc tehnologia CRISPR pentru detectarea HIV și altor virusuri ARN
Cercetătorii de la Universitatea Rice au dezvoltat o versiune optimizată a tehnologiei Cas13a, care vizează ARN-ul, materialul genetic întâlnit în virusuri precum HIV.
De-a lungul timpului, oamenii de știință au folosit un instrument puternic de editare genetică numit CRISPR pentru a realiza modificări precise ale ADN-ului. Tehnologia Cas13a, o variantă a acesteia, se concentrează pe ARN, ceea ce o face potrivită pentru detectarea virusurilor. Recent, echipa de cercetare de la Universitatea Rice a anunțat o versiune îmbunătățită a Cas13a, care ar putea facilita identificarea HIV și a altor virusuri ARN în probe de sânge și medii de mediu. Studiul a fost publicat în revista Cell Chemical Biology.
„Orice enzimă utilizată într-un test trebuie să fie atât sensibilă, cât și stabilă”, a declarat Yang Gao. „Trebuie să fie capabilă să detecteze cantități foarte mici de ARN, rezistând în același timp la condiții dure, cum ar fi temperaturi ridicate. Aici, am preluat un Cas13a stabil și l-am inginerat pentru a avea sensibilitatea dorită.”
Într-un test de detectare, o enzimă precum Cas13a se leagă de ținta sa – de exemplu, o fâșie de ARN dintr-un virus precum HIV sau SARS-CoV-2 – și produce un semnal, cum ar fi o lumină colorată sau o schimbare de culoare, care poate fi citit de o persoană sau de o mașină. În majoritatea testelor, drumul către producerea unui semnal necesită condiții dure. Echipa a început cu o variantă de Cas13a capabilă să reziste acestor condiții, dar care nu putea detecta cantități foarte mici de ARN țintă.
„Problema pe care o aveam era legată de sensibilitate”, a declarat Seye Oladeji. „Ideal, un test de detectare ar trebui să îți spună dacă există chiar și o singură fâșie de ARN pe microlitru de lichid – echivalentul unei picături de sânge. Varianta noastră de Cas13a stabil nu era suficient de sensibilă: o problemă perfectă pentru o abordare inginerie.”
Pentru a transforma acest Cas13a stabil într-o variantă mai sensibilă, Oladeji a trebuit mai întâi să înțeleagă cum funcționează. Acest lucru a necesitat rezolvarea structurii proteinei, adică colectarea de suficiente informații pentru a desena cu exactitate componentele enzimei și modul în care acestea se pliază. Cas13a este o proteină care se mișcă mult în timpul legării, ceea ce face dificilă capturarea ei în detaliu. Oladeji a conceput o metodă de fixare a CRISPR/Cas13a și a ARN-ului țintă în timp ce se colectau informații despre structura sa.
Odată ce structura Cas13a a fost rezolvată, echipa a reușit să identifice regiunile enzimei care ar putea crește sensibilitatea. Au selectat două regiuni pentru a fi ingineriate și au testat rezultatele în laborator. Când ambele regiuni au fost modificate, enzima a fost prea sensibilă și semnala chiar și în absența ARN-ului țintă. Însă, când doar o singură regiune a fost modificată, sensibilitatea a crescut de 100 de ori fără nicio pierdere de stabilitate.
„Am testat Cas13a ingineriat, care era sensibil – dar nu prea sensibil – împotriva unui eșantion sintetic noninfecțios de HIV și am descoperit că a funcționat în testul nostru de detectare cu o îmbunătățire a performanței de 100 de ori”, a declarat Oladeji. „A fost o experiență palpitantă și o bună reamintire să fim atenți să nu supraingineriem o proteină.”
Deși testul echipei a detectat HIV, avantajul utilizării unui sistem CRISPR este flexibilitatea acestuia. Enzima Cas13a este asociată cu un ghid care este programat să vizeze o secvență specifică de ARN. Este ușor de schimbat ghidul programat – echipa ar putea folosi, de exemplu, aceeași enzimă Cas13a și să-și reprogrameze ghidul pentru a detecta SARS-CoV-2, virusul gripal, virusul Ebola, virusul Zika, virusul sincitial respirator sau virusul hepatitei C în loc de HIV.
„Într-un sistem CRISPR, enzima este asociată cu un ghid care vizează o secvență particulară de ARN”, a spus Gao. „Ghidul este ușor de programat, astfel că partea esențială a sistemului este să ai o enzimă compatibilă cu testele tale. Versiunea noastră de Cas13a este optimizată pentru teste de detectare ARN sensibile și stabile și ar putea fi utilizată potențial în teste comerciale precum RT-qPCR și flux lateral.”
