Cercetătorii analizează toxinele de cobră pentru a descoperi un peptid antimicrobian distructiv pentru membrană
O căutare computațională a cardiotoxinelor de cobră a pus la testare 14 peptide inspirate din venin, supunându-le unor analize structurale, antibacteriene și de toxicitate, oferind o evaluare riguroasă asupra cât de departe poate ajunge descoperirea de peptide ghidată de AI.
Un studiu recent publicat în jurnalul NPJ Drug Discovery a identificat și evaluat candidații pentru peptide antimicrobiene derivate din cardiotoxinele de cobră prin mineraj computațional, prioritizare prin învățare automată și screening experimental, explorând astfel o abordare inspirată din venin pentru descoperirea de medicamente antimicrobiene.
Veninurile de șarpe reprezintă un rezervor divers de molecule bioactive cu un potențial remarcabil ca agenți antiinfecțioși. Peptidele și proteinele derivate din venin, evoluate pentru a perturba procesele celulare și imunologice în prăzi și pradă, posedă, de asemenea, proprietăți antimicrobiene înnăscute, făcându-le șabloane promițătoare pentru dezvoltarea de medicamente. Totuși, metodele tradiționale de descoperire, care se bazează pe izolare biochimică și screening funcțional, sunt limitate de complexitatea mixturilor de venin și de provocările asociate cu producerea biomoleculelor mai mari.
Avansurile recente în tehnologiile omice au extins bazele de date ale secvențelor proteinelor din venin, expunând o diversitate moleculară semnificativă, dar neexploatată. Aceste seturi de date permit proiectarea rațională a peptidele inspirate din toxine prin recapitulara motivelor structurale sau fizico-chimice esențiale pentru activitatea biologică. Fragmentele de peptide bioactive pot fi criptate în secvențe mai mari de toxine și pot manifesta activitate doar după eliberare. Chiar și cu acest potențial, extracția și validarea sistematică in silico a peptidelor antimicrobiene din secvențele de venin rămâne limitată.
Cardiotoxinele (CTX) din speciile Naja, care aparțin familiei toxinelor cu trei degete, sunt deosebit de potrivite pentru minerajul computațional al peptidelor datorită dimensiunii lor compacte, integrității structurale și proprietăților de legare la membrană. Proteinele bazice asemănătoare cardiotoxinelor (CLBP), deși sunt legate structural, au fost în mare parte neglijate în cercetarea antimicrobiană.
Integrarea AI cu venomics permite acum o predicție rapidă a potențialului antimicrobian și prioritizarea motivelor bioactive presupuse în datele secvenței. Totuși, abordările cuprinzătoare care combină minerajul secvenței de toxine cu predicția peptidelor bazate pe AI nu au fost implementate pe scară largă. O lacună critică rămâne în identificarea și caracterizarea in silico a peptidelor antimicrobiene din toxinele veninului de șarpe, în special CTX și CLBP.
Pentru a identifica peptide antimicrobiene noi, 14 candidați au fost selectați sau proiectați folosind minerajul secvenței și prioritizarea computațională din cardiotoxinele/citotoxinele Naja (cobră). Candidații pentru peptide au fost evaluați folosind instrumente de predicție a peptidelor antimicrobiene și hemolizei bazate pe învățare automată, cu CTX-p7 modificat chimic exclus din unele analize in silico. Peptidele au fost sintetizate folosind chimia Fmoc pe fază solidă, iar puritatea a fost evaluată prin cromatografie de lichide de înaltă performanță (HPLC), iar masele lor moleculare au fost confirmate prin spectrometrie de masă (MS).
Caracteristicile structurale au fost evaluate folosind predicția structurii proteinelor AlphaFold2, proiecții de roată helicoidală pentru a evalua amfipaticitatea și spectroscopia de dichroism circular (CD) în condiții care imită membranele. Activitatea antibacteriană a fost cuantificată prin teste de diluție microbiană în brodă împotriva bacteriilor Gram-negative și Gram-pozitive. Screeningul antimicrobian prin diluție în brodă a fost repetat independent de trei ori, fiecare test fiind efectuat în triplicat. Perturbarea membranei a fost studiată prin metode de microscopie de forță atomică (AFM) și colorare fluorescentă.
Asiile mecanice au inclus evaluarea permeabilității membranei externe bacteriene utilizând testul de absorbție N-phenyl-1-naphthylamine (NPN) și depolarizarea membranei interne bacteriene folosind testul de iodură de 3,3′-dipropiltiadicarbocianină [DiSC3(5)].
Pentru a explora potențialul cardiotoxinelor din veninul de șarpe ca șabloane pentru proiectarea peptidelor antimicrobiene, secvențele de CTX din speciile Naja au fost extrase din bazele de date publice de proteine și analizate pentru similaritate de secvență. Compararea secvențelor a relevat o conservare ridicată, indicând că motivele structurale și funcționale sunt păstrate.
Două strategii au ghidat selecția fragmentelor de peptide derivate din CTX, prioritizate folosind instrumente de predicție AMP bazate pe învățare automată. Prima strategie a implicat extragerea regiunilor conservate din opt CTX bine caracterizate și analiza acestor fragmente folosind algoritmul de Activitate a Peptidelor Antimicrobiene (AMPA), obținând șapte peptide native; două derivate suplimentare au fost apoi proiectate din CTX-p5. A doua abordare a generat o secvență de consens din 92 de CTX Naja și a folosit-o pentru a proiecta cinci peptide suplimentare bazate pe reziduuri de aminoacizi conservate.
Algoritmul AMPA a identificat șapte regiuni antimicrobiene presupuse. Evaluările ulterioare cu instrumente de predicție antimicrobiană și hemolitică au susținut prioritizarea computațională, cu un total de nouă peptide din această strategie: șapte fragmente derivate din CTX native și două derivate din CTX-p5, CTX-p6 (cationicitate crescută) și CTX-p7 (coadă palmitoil pentru interacțiunea cu membrana). Strategia bazată pe consens a generat cinci peptide suplimentare (CTX-p10–CTX-p14). Majoritatea peptidelor au primit scoruri antimicrobiene ridicate din cel puțin două modele, deși rezultatele au variat între algoritmi.
Analiza fizico-chimică in silico a identificat CTX-p6 și CTX-p14 ca fiind cele mai promițătoare, urmate de CTX-p5 și CTX-p9, dar testele experimentale ulterioare au identificat CTX-p5 ca fiind cel mai activ peptid. CTX-p11 a avut o propensitate ridicată la agregare prezisă. Cele 14 peptide au fost sintetizate, HPLC confirmând puritatea de peste 95% și spectrometria de masă verificând masele moleculare așteptate.
Analiza structurală a relevat o diversitate semnificativă printre peptidele inspirate din CTX. Modelarea AlphaFold a prezis o propensitate parțială helicoidală pentru mai multe, dar fiabilitatea sa pentru secvențe scurte și flexibile este limitată. AlphaFold a prezis conformații parțial pliate sau de tip β-hairpin pentru unele peptide, în timp ce proiecțiile de roată helicoidală au ilustrat separat distribuțiile teoretice ale reziduurilor amfipatică presupunând o α-helix idealizată. Aceste proiecții teoretice
