Optimizarea fluxurilor de lucru CRISPR, de la editare la analiză
Editarea genetică CRISPR este un instrument valoros folosit pentru modificarea, eliminarea sau corectarea anumitor regiuni ale ADN-ului. Aceasta are aplicații în cercetare, accelerând investigațiile în boli precum cancerul, precum și în dezvoltarea unor terapii celulare și genice pentru utilizare clinică, cum ar fi Casgevy, care a primit recent aprobarea FDA.
Există numeroase provocări inerente în ceea ce privește eficiența editării și analizei CRISPR, iar simplificarea fluxurilor de lucru este crucială. De aceea, INTEGRA a colaborat cu companiile biotehnologice DropGenie și QUiCKR Bio pentru a crea soluții automate eficiente, care profită de robotul de pipetare ASSIST PLUS, pipeta cu distanța ajustabilă VOYAGER, pipeta electronică VIAFLO și pipeta electronică portabilă MINI 96.
Procesele de descoperire și dezvoltare CRISPR implică două etape critice: editarea genelor, urmată de confirmarea că rezultatul dorit a fost obținut. Reagenții de editare trebuie introduși în celule sensibile și prețioase, adesea greu de obținut, fără a compromite viabilitatea; un proces consumator de timp și predispus la erori dacă este realizat manual. Analiza ulterioară pentru a confirma succesul editării se bazează adesea pe fluxuri de lucru complexe de secvențiere care pot dura zile sau chiar săptămâni, întârziind experimentele viitoare. Totuși, automatizarea poate crește viteza și reproducibilitatea fluxurilor de lucru CRISPR.
Combinarea miniaturizării și automatizării aduce avantaje cercetătorilor CRISPR. Miniaturizarea permite laboratoarelor să efectueze mult mai multe experimente cu un volum de material de pornire mult mai mic, în timp ce automatizarea accelerează fluxul de lucru și reduce costurile, îmbunătățind astfel productivitatea și repetabilitatea, eliminând, în același timp, posibilitatea erorilor umane. DropGenie, cu sediul în Montreal, Canada, se concentrează pe miniaturizarea fluxurilor de lucru din biologia celulară și moleculară, pentru a accelera ritmul editării genelor, genomica funcțională și cercetarea în descoperirea de medicamente. Aceste aplicații necesită manipularea cu grijă a probelor prețioase pentru a genera date biologice semnificative.
Co-fondatorul DropGenie, Hugo Sinha, a explicat: „Am dezvoltat o platformă de transfecție cu volum redus și capacitate mare – DropGenie Transfection Platform – pentru a livra diverși compuși intracelulari și pentru a studia efectele acestora. Este o platformă care are aplicații în fluxurile de lucru din genomica funcțională, ingineria celulară și screeningul medicamentelor, în special pentru marii producători de medicamente care doresc să crească profunzimea datelor produse în timpul fazei de descoperire a medicamentelor.”
Cele mai multe fluxuri de lucru convenționale de transfecție necesită aproximativ un milion de celule pentru fiecare editare, în timp ce platforma DropGenie necesită doar 10.000 – o reducere de 100 de ori. Hugo a continuat: „În loc să scalăm ecranele în jurul unor intrări mari de celule, dispozitivul nostru – care este practic un laborator pe un cip – combină două tehnologii, miniaturizarea folosind microfluidica digitală și electroporarea tri-drop. Dispune de 48 de site-uri de reacție independente, programabile, unde celulele, Cas9 și ARN-urile ghid pot fi combinate și electroporate în volume mici, pentru o editare eficientă a genomului cu cerințe drastic reduse de material celular. Reducerea masivă a materialului de intrare înseamnă că pot fi efectuate de 100 de ori mai multe experimente cu aceeași cantitate de material de pornire, dar voiam, de asemenea, să simplificăm procesul, iar automatizarea este cheia.”
Protocolul DropGenie începe prin depozitarea de încărcături de nanolitri de ARN ghidat (sgRNA) pe cartuș înainte de asamblare. Odată ce cartușul este asamblat, ASSIST PLUS este utilizat pentru a încărca celulele și reagenții pe dispozitiv pentru electroporarea tri-drop. După stingerea reacției, celulele electroporate sunt descărcate în plăci de bine de către ASSIST PLUS, gata pentru analiza ulterioară. „Ne place ASSIST PLUS din multe motive,” a spus Hugo. „Se integrează perfect cu formatul de testare și manipulează cu grijă celulele primare sensibile. Avem control total asupra vitezei și înălțimii pipetării, permițând transferuri fără bule care păstrează integritatea celulelor, și am demonstrat eficiența în knock-out CRISPR cu o recuperare și viabilitate excelente; eficiența knock-out TRAC a fost de 92,5% în celulele T CD4+ și 90,9% în celulele T CD8+, cu CV-uri sub 5%.”
Odată ce etapa de editare genetică este completă, rezultatul trebuie cuantificat. În trecut, acest lucru se realiza prin NGS sau droplet digital PCR (ddPCR), ambele fiind consumatoare de timp. QUiCKR Bio, cu sediul în New York, oferă teste pre-plasate și analize pe platformă cloud pentru a permite cuantificarea oricărei secvențe ADN cu acuratețe la nivel de NGS în doar 20 de minute, și și-a automatizat procesul pe ASSIST PLUS, VIAFLO 96 și MINI 96. Testul QUiCKR este conceput pentru optimizarea candidaților terapeutici, ARN-urilor ghid, enzimelor, răspunsurilor la doze sau condițiilor de proces, permițând cercetătorilor să determine rapid dacă editarea dorită a avut loc prin cuantificarea rezultatelor editării, numărului de copii sau titrării genomice.
Co-fondatorul și CEO-ul QUiCKR, Charles Blanluet, a explicat: „Testul QUiCKR a fost inițial dezvoltat ca un diagnostic COVID din cercetarea mea de la Laboratorul de Microfluidică de la Stanford. Acest test cantitativ înlocuiește fluxurile de lucru lungi și complexe, precum NGS sau ddPCR, și este la fel de aplicabil în editarea genică cât și în controlul calității genomului viral. Obiectivul nostru este să permitem citiri rapide și precise ale editărilor pentru toată lumea, de la oamenii de știință de bancă la nucleele NGS. Pentru oamenii de știință individuali, înseamnă că nu mai trebuie să aștepte zile sau săptămâni pentru ca fluxurile de lucru lungi și complexe să fie realizate de nucleele analitice, permițându-le să își ajusteze experimentele în aceeași zi.”
QUiCKR colaborează cu companii farmaceutice și biotehnologice pentru a livra teste pentru optimizarea candidaților terapeutici și controlul calității manufacturării, ajutând la accelerarea drumului către clinică și aprobarea reglementărilor pentru noi medicamente. Charles a continuat: „QUiCKR este un kit complet și o soluție bazată pe software adaptată pentru utilizarea specifică a clientului. Include plăci personalizate, gata de utilizare, care pot fi utilizate pe cititoare de fluorescență existente și platforme de automatizare, precum și software pentru analiza ulterioară. Tot ce trebuie să facă utilizatorul este să adauge ADN-ul diluat în serie în placa QUiCKR și să o plaseze într-un cititor de fluorescență. Datele brute de fluorescență sunt apoi analizate prin tragerea și plasarea unui fișier CSV în software-ul nostru.”
Pipetarea manuală a unui test bazat pe plăci de 384 de puțuri, cum ar fi QUiCKR, necesită abilități puternice de pipetare pentru a asigura transferuri de lichide precise și fără erori. „Pipetarea manuală în plăci de 384 de puțuri este plictis
