Un instrument de explorare genomică descoperă un nou antibiotic într-un cluster genic tăcut
Cercetătorii au dezvoltat un instrument numit DiscERN, care a identificat un cluster genic tăcut ce produce discomycin A, oferind o metodă mai direcționată pentru a transforma genomurile microbiene în candidați pentru antibiotice.
DiscERN, un instrument automatizat pentru minerit genomic, a fost prezentat recent într-un articol în presa de specialitate în revista Nature Communications. Creșterea rezistenței antimicrobiene (AMR) reprezintă o criză globală semnificativă în domeniul sănătății, ceea ce a determinat reluarea eforturilor de a descoperi noi tipuri de antibiotice. Produsele naturale bacteriene au fost sursa principală de antibiotice, iar datele genomice sugerează că capacitatea de sinteză a produselor naturale este codificată în interiorul clusterelor de gene biosintetice (BGC-uri). Acestea funcționează ca linii de asamblare moleculare și conțin planurile enzimatice pentru producția de produse naturale specifice.
Studiile au arătat constant că numărul de BGC-uri depășește numărul de compuși izolați din aceleași organisme. Astfel, aceste BGC-uri criptice sau tăcute reprezintă o oportunitate de a identifica molecule bioactive noi. Deși există instrumente pentru identificarea de novo a BGC-urilor, metodele dedicate optimizate pentru expansiunea țintită, multi-referință a familiilor de BGC definite de utilizator sunt limitate.
În cadrul studiului, cercetătorii au utilizat patru algoritmi complementari pentru a captura aspectele distincte ale relației evolutive: Pfam Vector, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Vector, BLAST Rank și Structural K-mer Intersection. Acești algoritmi clasifică BGC-urile pe baza conținutului domeniului Pfam și a similarității secvenței proteinelor, iar structura produsului prezis este folosită pentru familii compatibile de sintaze de peptide non-ribozomale și sintaze de poliketide.
Algoritmii au fost integrați în ansamblul DiscERN, care a fost aplicat pe un set de date format din 3.561 de genomuri de Actinobacterii. Acest set de date a fost construit prin interogarea bazei de date a Centrului Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI) pentru genomuri din clasa Actinobacterii, incluzând doar genomuri de referință și reprezentative.
Genomurile au fost procesate cu Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell (antiSMASH) pentru a genera 59.236 de BGC-uri. Apoi, DiscERN a analizat rezultatele antiSMASH folosind patru familii de antibiotice ca referințe: macrolide cu 16 membri, poliketide de tip rifamicină, lipopeptide dependente de calciu și glicopeptide. Aceasta a dus la 688 de sugestii potențiale, cu până la 20 curate manual pentru fiecare familie și nivel de încredere, atunci când numărul de candidați era mare.
Clusterele examinate au fost clasificate ca fiind adevărate pozitive, false pozitive sau nedeterminate atunci când fragmentarea a împiedicat o atribuire sigură. Analiza manuală a falselor negative nu a fost fezabilă din cauza numărului vast de BGC-uri din setul de date. Astfel, a fost folosită analiza leave-one-out (LOO) pentru a estima recall-ul pentru cele patru familii de BGC de referință. DiscERN a clasificat BGC-ul reținut pentru fiecare fold LOO, iar numărul de algoritmi care au oferit suport (k) a fost înregistrat, k indicând câți dintre cei patru algoritmi au identificat independent clusterul.
În analiza combinată a autorilor, un prag de încredere de k ≥ 2, indicând suport din cel puțin doi algoritmi, a generat cel mai mare scor F1 estimat de 0,89, echilibrând un recall estimat de 0,95 cu o precizie de 0,84. Un prag mai mare (k ≥ 3, cerând acordul din partea a cel puțin 3 algoritmi) a crescut precizia estimată la 0,98, cu practic toate sugestiile previzibile clasificate ca adevărate pozitive. Printre BGC-urile identificate ca având potențial de a codifica produse naturale noi, a fost selectat un hit potențial din familia antibioticelor dependente de calciu (CDA) din Streptomyces kanamyceticus pentru analize suplimentare.
Această BGC, numită discomycin (dsc), a fost aleasă deoarece era prezentă într-o tulpină disponibilă comercial, fără rapoarte anterioare de activitate CDA și pentru că conținea un gen de proteină de reglementare antibiotică Streptomyces (SARP), sugerând un mod de activare. Cercetătorii au integrat o copie suplimentară a genului SARP în cromozomul S. kanamyceticus sub un promotor constitutiv puternic pentru a activa BGC-ul tăcut dsc. Apoi, au clonat întregul cluster dsc și l-au exprimat în gazda minimizată genomic Streptomyces albus Del14, confirmând că discomycin A a fost produsul direct al BGC-ului dsc.
În continuare, echipa a evaluat activitatea biologică a discomycinei A purificate împotriva bacteriilor utilizând teste de microdilutie. Discomycin A nu a arătat activitate împotriva bacteriilor Gram-negative examinate. Cu toate acestea, a demonstrat o activitate antibacteriană puternică dependentă de calciu împotriva mai multor bacterii Gram-pozitive, inclusiv Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus rezistent la meticilină USA300 și Bacillus subtilis. Evaluarea citotoxicității împotriva celulelor de carcinom colorectal uman HCT-116 nu a relevat citotoxicitate discernibilă a discomycinei A în condițiile testului.
Tratamentul cu S. aureus la niveluri sub-inhibitorii de discomycin A a dus la acumularea de N-acetilmuramic acid (NAM) pentapeptid, consistent cu inhibarea biosintezei peretelui celular. În cele din urmă, echipa a comparat DiscERN cu două platforme de minerit genomic, Gene Clusters Assessment Tool for Orthologous Regions (GATOR-GC) și Biosynthetic Gene Similarity Clustering and Prospecting Engine (BiG-SCAPE). Compararea a implicat expansiunea țintită a familiei antibioticelor dependente de calciu în 573 de genomuri de Streptomyces. În acest benchmark specific, DiscERN a depășit ambele comparații, generând mai multe adevărate pozitive și o proporție mai mare de structuri peptidice potențial noi decât oricare dintre cele două platforme. Notabil, BiG-SCAPE nu a identificat BGC-ul dsc, în timp ce GATOR-GC l-a identificat. GATOR-GC a returnat, de asemenea, un alt hit pe care nici BiG-SCAPE, nici DiscERN nu l-au identificat.
În concluzie, DiscERN este un instrument multimodal pentru expansiunea țintită, bazată pe ipoteze, a familiilor de BGC definite de utilizator. Studiul a validat acest flux de lucru printr-o analiză cuprinzătoare de benchmarking și a identificat discomycin A, un antibiotic nou provenit dintr-un BGC tăcut. Rezultatele sugerează că DiscERN oferă o platformă accesibilă și robustă care simplifică procesul de la datele genomice la o listă prioritizată de BGC-uri candidate pentru validare experimentală, bridgind astfel decalajul dintre predicția în silico și descoperirea compușilor bioactivi. Cu toate acestea, va fi necesară o cercetare suplimentară pentru a evalua discomycin A în modele animale și pentru a caracteriza farmacocinetica și siguranța sa mai largă în cadrul mamiferelor.
