O platformă inovatoare pentru producția la scară largă de proteine personalizate
O echipă de cercetători lucrează de mai bine de 20 de ani pentru a instrui sisteme biologice, precum celulele E. coli, să producă proteine pe care nu le generează în mod natural.
Realizarea acestui obiectiv ar putea aduce soluții inovatoare, rapide și mai ieftine pentru domenii precum medicina, agricultura, știința materialelor, remedierea mediului și alte industrii.
Drumul până acum a fost dificil. Se credea că cea mai bună – și poate singura – metodă de a atinge acest scop era reprogramarea ADN-ului unui organism, însă acest proces s-a dovedit a fi extrem de complicat și consumator de timp, generând rezultate slabe.
Laboratorul geneticistului George Church de la Harvard Medical School și Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering a dezvoltat o metodă mai simplă, rapidă, sigură și la scară largă pentru a crea proteine noi, fără a necesita recodificarea genomului sau chiar organisme vii.
Instrumentul lor, numit AGENTEX și raportat pe 26 august în revista Nature, le permite cercetătorilor să proiecteze proteine folosind până la 34 de aminoacizi, în loc de cei 20 care există în mod natural; să inginerieze două tipuri de blocuri de construcție (tRNA și ribozomi) necesare pentru a crea aceste proteine; și să introducă blocurile de construcție într-o soluție de laborator standard care conține componente celulare, dar fără celule propriu-zise. Acolo, componentele generează noile proteine fără a interfera cu mecanismul natural de sinteză a proteinelor.
„AGENTEX permite cercetătorilor să genereze coduri genetice complet noi, la cerere, în tuburi de testare și să le folosească la scară pentru a construi proteine mult mai complexe decât cele evoluate de natură”, a declarat primul autor Felix Radford, cercetător asociat în genetică în laboratorul Church. „Aceasta este mai rapidă și mai sigură decât metodele existente, deoarece nu se bazează pe manipularea celulelor vii sau pe modificarea genomurilor lor.”
Pe parcurs, echipa a descoperit ceva neașteptat despre unul dintre cele mai fundamentale procese ale vieții pe Pământ: modul în care ADN-ul este tradus în proteine.
„A fost cu adevărat uimitor să lucrăm în acest mediu, deoarece nu numai că dezvoltăm tehnologii noi și inovatoare, dar descoperim și știință nouă în același timp”, a adăugat Radford.
Toată viața naturală este alcătuită din proteine, iar proteinele sunt construite din combinații de doar 20 de aminoacizi. Fiecare aminoacid este codificat de un triplet de baze de ADN sau ARN numit codon. Totuși, există de aproximativ trei ori mai mulți codoni decât aminoacizi. De exemplu, UCU, UCC, UCA și UCG codifică toate serina. Această redundanță sugerează că mulți codoni ar putea fi reprogramați pentru a produce altceva.
După nouă ani de eforturi, laboratorul Church a demonstrat în 2013 că acest lucru este posibil, eliberând un codon în bacteriile E. coli pentru a permite microbilor să producă orice nou aminoacid pe care cercetătorii îl doreau. A fost nevoie de încă 10 ani pentru a elibera un al doilea codon, permițând E. coli să creeze alți aminoacizi noi. Astfel, cercetătorii au putut ingineriza celule pentru a produce proteine care conțin până la 22 de aminoacizi diferiți.
Progresele la nivel mondial au rămas lente și pline de provocări, inclusiv faptul că reprogramarea codonului afectează alte funcții normale ale celulelor și că organismele inginerizate genetic trebuie să fie păstrate în siguranță „împrejmuite” de viața naturală.
AGENTEX reprezintă un salt înainte, făcând 34 de codoni personalizabili, permițând cercetătorilor să creeze proteine cu până la 34 de aminoacizi diferiți. Și o face în tuburi de testare, fără a atinge ADN-ul natural al unui organism.
„Ne-a luat un deceniu pentru fiecare nou aminoacid adăugat la cod, așa că această realizare deschide remarcabil ușa la 34 de aminoacizi deodată și cu aproape niciunul dintre daunele colaterale obișnuite asupra genomului”, a spus Church.
Descoperirea transformă ingineria proteinelor într-o platformă mai apropiată de designul molecular și de descoperire. Mii de molecule unice pot fi construite, testate și evoluate în paralel, fără anii de rescriere a genomului în celulele vii care erau anterior necesari pentru a adăuga fiecare nou aminoacid.
Un aspect crucial al acestei lucrări a fost descoperirea care schimbă decenii de înțelegere despre ARN-ul de transfer (tRNA). Aceste molecule adaugă aminoacizi unul câte unul într-un lanț pentru a construi o proteină, fiind esențiale atât pentru sinteza proteinelor naturale, cât și pentru cea inginerizată. Există tRNA care corespund fiecărui codon din genom; de exemplu, unul se potrivește cu UCU și atașează o serină la lanț.
Fiecare tRNA are secvența genetică CCA la capătul său. Dogma a susținut că orice altă secvență în acel loc va marca tRNA ca defect. Enzimele nu vor permite tRNA-ului să primească încărcătura sa de aminoacizi, iar ribozomii – fabricile în care se produc proteine – nu vor permite tRNA-ului să livreze acea încărcătură.
Cu toate acestea, spre surprinderea lor și în contrast cu dovezile anterioare, Radford și colegii săi au descoperit că prima parte nu este adevărată. Enzimele permit unor tRNA cu secvențe alternative la capăt să primească aminoacizi. Un instrument pe care echipa l-a construit ca parte a AGENTEX, numit tSCAN, a identificat secvențele non-standard care funcționează cel mai bine, inclusiv CGA.
„Am demonstrat că putem modifica una dintre cele mai fundamentale părți ale unuia dintre cele mai fundamentale sisteme găsite în natură, sistemul de sinteză a proteinelor care a existat practic neschimbat timp de miliarde de ani în toate organismele, și este funcțional”, a menționat Radford. „Capătul CCA este mult mai flexibil decât oamenii au presupus.”
Revelația că oamenii de știință pot crea tRNA funcționale care nu se termină cu CCA este importantă, deoarece tRNA-urile non-CCA nu vor fi acceptate în ribozomii naturali atunci când sunt adăugate în celule sau în soluții cu componente celulare. În schimb, cercetătorii pot ingineriza ribozomi care funcționează doar cu tRNA care au o secvență alternativă specifică, cum ar fi CGA. Aceste tRNA alternative pot fi desemnate să transporte orice aminoacid doresc cercetătorii, fie el natural sau nou.
Cercetătorii au căutat această procesare separată, alături, a proteinelor timp de ani de zile.
AGENTEX – prescurtat de la automatizarea expansiunii genetice tRNA – oferă un flux de lucru pentru realizarea tuturor acestor pași de la început până la sfârșit. Include software pe care echipa lui Church l-a scris, disponibil gratuit, care poate fi utilizat pe un robot open-source vândut de compania Opentrons.
În prima etapă, cercetătorii pot folosi AGENTEX pentru a proiecta și produce tRNA cu diferite secvențe alternative la capăt și orice dintre cei 34 de aminoacizi. AGENTEX poate testa loturi în soluții lysate cunoscute și poate raporta care variante
