O structură ascunsă ar putea explica modul în care bacteriile intestinale ale sugarilor obțin nutrienți
O nouă structură β-sheet identificată ajută o enzimă din bacteriile intestinale asociate sugarilor să recunoască și să proceseze fragmentele de proteine ce conțin zaharuri, dezvăluind un mecanism specializat care ar putea oferi informații despre modul în care microbii accesează nutrienții în intestinul în dezvoltare al sugarilor.
Un studiu publicat în Nature Communications a arătat cum o enzimă dintr-o bacterie intestinală asociată sugarilor recunoaște și elimină zaharurile din fragmentele scurte de proteine. Descoperirile identifică o caracteristică structurală până acum neobservată, care ajută la explicarea preferinței enzimei pentru glicopeptide și ar putea contribui la înțelegerea modului în care bacteriile intestinale procesează glicanii derivați de la gazdă.
Glicanii N-glicani sunt structuri complexe de zahăr atașate proteinelor, inclusiv proteinelor din laptele matern. Acești glicani reprezintă substraturi potențiale pentru bacteriile din intestinul sugarilor, unde enzimele specializate ajută la eliberarea lor din proteine.
Printre aceste enzime se numără peptidele N-glicozilaze (PNGaze), care cleavează N-glicanii din atașamentele lor proteice sau peptidice. Cu toate acestea, mare parte din înțelegerea structurală existentă a acestor enzime provine din studiul PNGazei F, lăsând întrebări despre modul în care alte familii de PNGaze recunosc peptidele glicozilate.
Cercetătorii au investigat o enzimă din familia PNGaze A, denumită PNGaseABif, identificată în două tulpini de Bifidobacterium bifidum, inclusiv tulpina asociată sugarilor LMG13195. Se preconizează că enzima este ancorată la suprafața celulară a bacteriei, sugerând un rol posibil în procesarea glicopeptidelor extracelulare.
Enzima bacteriană prezintă o preferință puternică pentru glicopeptide. Cercetătorii au testat PNGaseABif împotriva glicoproteinelor ce conțin diferite tipuri de N-glicani, comparând proteinele native, proteinele denaturate și glicopeptidele mai mici generate prin digestie proteolitică.
PNGaseABif a preferat cu tărie glicopeptidele, a arătat o activitate limitată împotriva glicoproteinelor denaturate și nu a avut activitate detectabilă împotriva formelor native ale celor trei glicoproteine principale în condițiile testate. Spre comparație, enzima de control PNGaseL a fost activă împotriva tuturor celor trei preparate de substrat.
Enzima a eliberat mai multe tipuri de N-glicani, inclusiv structuri de tip înalt-mannos și complexe. De asemenea, a eliberat glicani α1,3-fucosilați din peroxidaza de hrean, dar nu din fosfolipaza A2 de albină, sugerând că mediul proteic înconjurător influențează accesibilitatea substratului și activitatea enzimei.
Aceste descoperiri indică faptul că preferința substratului PNGaseABif depinde nu doar de compoziția glicanelor, ci și de modul în care glicanii sunt prezentați pe proteina sau peptidul atașat.
Pentru a investiga această preferință, cercetătorii au determinat trei structuri cristaline ale PNGaseABif, inclusiv o mutantă dublă cu activitate catalitică afectată, legată de o glicopeptidă. Aceasta a oferit prima structură raportată a unei enzime din superfamilia PNGaze în complex cu o glicopeptidă.
Structurile au dezvăluit o regiune suplimentară cu zece fire β-sheet, denumită „cradle”, poziționată alături de nucleul catalitic al enzimei. Împreună, aceste structuri formează un buzunar în formă de C care poate acomoda o glicopeptidă scurtă.
În contrast cu fanta catalitică mai deschisă a PNGazei F, acest buzunar pare adaptat pentru poziționarea și închiderea parțială a substratelor peptidice scurte, ceea ce ar putea explica preferința PNGaseABif pentru glicopeptide în detrimentul glicoproteinelor mai mari.
Enzima recunoaște N-glicanul în principal prin cele două reziduuri de N-acetilglucozamină și manoză central, în timp ce peptidele atașate interacționează atât cu nucleul catalitic, cât și cu cradle-ul.
Particular important este reziduul de treonină situat la două poziții după asparagina glicozilată în secvența de recunoaștere NXT. Analiza structurală a identificat interacțiuni extinse implicând acest reziduu, sugerând că ajută la poziționarea glicopeptidelor pentru cleavare. Cu toate acestea, cercetătorii au examinat doar o singură secvență de glicopeptidă în structura legată, lăsând recunoașterea secvențelor NXS ce conțin serină nerezolvată.
Comparările între structurile nelegate și cele legate de glicopeptidă sugerează că cradle-ul se mișcă spre nucleul catalitic atunci când substratul se leagă. Simulările de dinamică moleculară au susținut acest mecanism propus de închidere, deși validația experimentală a contactelor individuale ale cradle-ului este încă necesară.
Structurile au oferit, de asemenea, indicii despre modul în care PNGaseABif îndepărtează N-glicanii. Două reziduuri catalitice, Asp107 și Glu236, sunt poziționate aproape de legătura care unește glicanii cu peptidele.
Cercetătorii au propus că Asp107 cel mai probabil activează o moleculă de apă pentru a facilita cleavarea, deși un atac nucleofil direct de către Asp107 rămâne o posibilitate alternativă. Mecanismul catalitic precis nu a fost stabilit încă.
Analizele computaționale au sugerat, de asemenea, că cradle-uri β-sheet similare ar putea apărea în întreaga superfamilie PNGaze A, indicând potențial o specializare mai largă pentru procesarea glicopeptidelor. Cu toate acestea, preferințele substratelor acestor omologi preziceți necesită confirmare experimentală.
Cercetătorii au propus, de asemenea, un model în care PNGaseABif de la suprafața celulară acționează asupra glicopeptidelor generate de proteazele gazdei sau microbilor. Deoarece tulpina studiată de B. bifidum nu are α-mannozidaze necesare pentru a degrada complet nucleele de N-glicani eliberate, aceste structuri ar putea deveni disponibile pentru alți microbi intestinali prin cross-feeding.
Acest rol ecologic propus rămâne ipotetic, deoarece studiul nu a demonstrat direct cross-feeding-ul glicanelor sau a investigat contribuția enzimei la creșterea bacteriană, colonizarea intestinului sugarilor sau la rezultatele de sănătate.
Studiul s-a bazat în principal pe experimente biochimice, structuri cristaline și modelare computațională. Dovezile structurale pentru recunoașterea peptidei provin dintr-o singură glicopeptidă NXT, în timp ce mișcarea propusă a cradle-ului și mecanismul catalitic necesită o validare experimentală suplimentară. Unele analize biochimice au avut, de asemenea, o replicare limitată.
Cu toate acestea, descoperirile stabilesc o explicație structurală pentru preferința PNGaseABif pentru glicopeptidele scurte. Prin identificarea modului în care cradle-ul β-sheet colaborează cu nucleul catalitic pentru a recunoaște și închide aceste substraturi, cercetarea av
