Cercetătorii de la Stanford au dezvoltat un instrument ultracompact pentru activarea genelor
Capacitatea de a ajusta cu precizie expresia genelor din organismul uman – amplificându-le pe cele protective și diminuându-le pe cele dăunătoare – are un potențial uriaș pentru tratarea și prevenirea bolilor.
Instrumentele moleculare standard utilizate pentru reglarea genelor, cum ar fi sistemul CRISPR, sunt prea voluminoase pentru a fi ambalate și livrate în celulele corpului.
Atunci când sunt livrate prin vectori virali, de exemplu, care sunt umpluți cu manualul de instrucțiuni ADN pentru ca celulele să construiască ele însele CRISPR, instrucțiunile lungi pentru CRISPR nu se încadrează în interiorul unui singur virus. Pentru terapiile care ar putea necesita ajustarea mai multor gene, livrarea separată a mai multor componente CRISPR devine complicată și ineficientă.
Acum, cercetătorii de la Stanford Medicine au dezvoltat o soluție de dimensiuni reduse – un instrument ultracompact pentru activarea genelor, numit TIGRa (pronunțat „tiger A”), suficient de mic pentru ca instrucțiunile sale ADN scurte să fie ambalate în vectori virali cu loc de rezervă.
Similar cu instrumentele de activare a genelor bazate pe CRISPR, odată ajuns în celulă, TIGRa identifică gena țintă și recrutează mecanismele de transcriere ale celulei pentru a amplifica expresia acelei secvențe. Comparativ cu omologii săi CRISPR, TIGRa este mai versatil în ceea ce privește genele pe care le poate viza și mai eficient în activarea simultană a mai multor gene.
Într-un model de șoarece, cercetătorii au folosit TIGRa pentru a amplifica două gene protective în celulele ganglionare retinale, celulele nervoase din ochi care sunt afectate în cazul glaucomului și altor afecțiuni degenerative retinale. Când celulele ganglionare retinale au fost rănite, șoarecii care au primit tratamentul au păstrat o parte din vedere; cei care nu au fost tratați au devenit aproape orbi.
„Acesta este un instrument care poate fi folosit pentru a activa gene care altfel ar rămâne inactive în corpul nostru”, a spus Yang Sun. Laboratorul lui Sun studiază biologia celulară a glaucomului și altor tulburări oculare. „Ochiul este un teren de testare ideal pentru terapiile de activare a genelor – un organ relativ accesibil cu semnale clare. Este mai ușor de măsurat dacă ochiul este capabil să vadă decât dacă ficatul funcționează”, a adăugat el.
TIGRa se bazează pe un sistem de enzime care vizează genele, cunoscut sub numele de TIGR-Tas, descoperit abia anul trecut de cercetătorii de la Broad Institute al Massachusetts Institute of Technology și Harvard University. Similar sistemului CRISPR-Cas, TIGR-Tas a fost descoperit în microbi; CRISPR a evoluat în bacterii ca un sistem imunitar care tăia și stoca bucăți de ADN de la virusuri infecțioase; TIGR-Tas a evoluat în bacterii și viruși paraziți, poate ca o armă genetică competitivă, deși funcția sa nu este încă clară.
Ambele sunt sisteme cu ghidare ARN și vizează ADN, ceea ce înseamnă că folosesc o bucată de ARN-ghid ca o fotografie de identificare pentru a găsi și a tăia o bucată corespunzătoare de ADN. Prin personalizarea ARN-ului-ghid, oamenii de știință pot direcționa aceste sisteme către diferite părți ale genomului.
În aproape 15 ani de la descoperirea CRISPR, cercetătorii au reinginerat acest sistem de găsire și tăiere într-o suită de instrumente CRISPR, inclusiv cele care editează secvența ADN a unei celule și altele care doar activează sau inhibă expresia genică. Acestea sunt acum instrumente de cercetare obișnuite în laborator, dar volumul lor a limitat utilizarea terapeutică în organism.
„Instrumentele existente de activare CRISPR sunt foarte puternice, dar dimensiunea lor este prea mare. Nu sunt potrivite pentru livrarea clasică prin virusuri asociate cu adeno”, a explicat Zhiquan Liu. TIGRa este primul instrument de activare a genelor bazat pe sistemul TIGR-Tas, mult mai compact. Este mai mic de jumătate din dimensiunea (măsurată prin numărul de aminoacizi) a activatorilor genici CRISPR comparabili.
Atunci când Liu a început să dezvolte un instrument mai mic pentru activarea genelor, a testat mai mult de o duzină de prototipuri moleculare bazate pe diferite sisteme care vizează genele. A fost surprins când TIGRa, unul dintre cele mai mici, s-a dovedit a fi cel mai eficient activator genic.
„De obicei, când dimensiunea este mai mică, eficiența va fi mai mică, dar TIGRa a avut o eficiență de activare foarte ridicată comparativ cu celelalte, chiar și având o dimensiune foarte, foarte mică”, a spus Liu. „Când am văzut pentru prima dată rezultatele, am fost cu toții foarte entuziasmați.”
Apoi, cercetătorii au conceput mai multe variante ale prototipului TIGRa, făcând modificări pentru a economisi și mai mult spațiu. TIGRa-Pro și TIGRa-Ultra sunt activatori genici ușor mai mici, dar mai puternici, iar TIGRa-Mini este o versiune extra-mică cu aproximativ 70% din eficiența originalului.
În celulele din laborator, echipa a demonstrat că TIGRa putea activa simultan până la 12 gene diferite. Ca o demonstrație, au folosit TIGRa pentru a reprograma fibroblastele adulte într-o stare embrionară (cunoscută sub numele de celule stem pluripotente induse), un proces care necesită activarea a șapte gene diferite în același timp.
TIGRa a egalat sau a depășit activatorii genici CRISPR în activarea unor gene diverse de interes terapeutic, inclusiv cele care ar putea contracara degenerarea retiniană, distrofia musculară congenitală și obezitatea.
„Am testat nouă gene diferite, iar în șase dintre ele sistemul TIGRa arată o eficiență de activare mai bună”, a spus Liu.
Pentru a testa livrarea terapeutică, cercetătorii au ambalat TIGRa în vectori virali care au fost apoi injectați în ochii șoarecilor. TIGRa a fost personalizat pentru a activa două gene, CaMKIIa și CaMKIIb, cunoscute pentru efectele lor protective asupra celulelor ganglionare retinale. Două săptămâni mai târziu, când șoarecii au primit o leziune retiniană care cauzează orbire, cei care au primit tratamentul TIGRa au păstrat aproximativ o treime din vedere.
„Am demonstrat că, prin injecția TIGRa, rata de supraviețuire a celulelor ganglionare retinale s-a îmbunătățit de două ori”, a spus Liu. „Am observat o conservare semnificativă a structurii retiniene și o protecție vizuală.”
Șoarecii tratați au continuat să prezinte o vedere păstrată patru luni mai târziu.
Rezultatele reprezintă o dovadă promițătoare de concept care ar putea dura încă câțiva ani până să fie aplicată în tratamentul degenerării retiniene la oameni. „În studiul nostru pe șoareci, am observat efecte protective eficiente cu aceste două gene, dar nu este suficient”, a spus Liu. „În viitor, deoarece aceste boli neurodegenerative sunt foarte complexe, trebuie
