O placă de fază laser îmbunătățește semnificativ imagistica cryo-EM
Într-o realizare remarcabilă în domeniul imagisticii biologice, cercetătorii de la Universitatea din California, Berkeley, și Biohub au anunțat astăzi demonstrarea cu succes a plăcii de fază laser, un dispozitiv inovator ce îmbunătățește dramatic contrastul imaginilor produse de microscoapele electronice cryo, deschizând astfel o nouă perspectivă asupra biologiei umane.
Microscopie electronică cryo (cryo-EM) este o tehnologie revoluționară, laureată cu Premiul Nobel, care a devenit fundamentul biologiei structurale, dezvăluind arhitectura la nivel atomic a multor mașini moleculare ce conduc aproape fiecare proces celular. Totuși, această tehnică a fost limitată de incapacitatea de a genera un contrast suficient pentru a imagina clar moleculele mici – mai mult de 90% dintre proteinele din celulele umane sunt prea mici pentru a fi capturate clar de cryo-EM.
Construind pe baza demonstrațiilor anterioare, cercetătorii de la Biohub și UC Berkeley au integrat o placă de fază laser, una dintre cele mai puternice lasere de acest tip din lume, într-un microscop electronic cryo de ultimă generație, așa cum este descris în două publicații recente. Rezultatul este un dispozitiv ce va oferi vederi asupra celulei ca niciodată până acum, permițând oamenilor de știință să observe procesele și interacțiunile fundamentale ale sănătății și bolii.
„Celula este plină de tot ceea ce ai vrea să știi – dar nu putem să o vedem și nu putem să o găsim. A observa toate acele interacțiuni a fost visul biologilor structurali de celule timp de decenii, iar acum suntem pe cale să realizăm asta. În opinia mea, placa de fază laser este esențială pentru a face acest lucru posibil”, a declarat David Agard.
Placa de fază laser a fost propusă pentru prima dată acum mai bine de 15 ani de fizicianul Holger Müller și biofizicianul Robert Glaeser, ambii de la UC Berkeley, dar a fost considerată mult timp aproape imposibil de construit. După ani de eforturi, au reușit să realizeze un prototip funcțional și să demonstreze aplicabilitatea sa în cryo-EM, utilizând un microscop electronic dintr-o generație anterioară.
Acum, cercetătorii de la Biohub și UC Berkeley au construit fiecare o placă de fază laser, instalată în versiuni personalizate ale microscopului Thermo Scientific Krios, și au demonstrat îmbunătățiri semnificative ale contrastului în imagistica proteinelor mici, așa cum este raportat în cele două lucrări științifice. Întreaga cavitate optică care adăpostește placa de fază laser – inima sistemului – are o lățime de mai puțin de patru inci și este plasată într-un microscop ce are o înălțime de 14 picioare.
Lucrarea de la UC Berkeley, publicată online astăzi în Science, demonstrează că placa de fază laser oferă o rezoluție mai mare pentru șase mostre biologice diferite, de dimensiuni și pregătire variate. În plus, cercetătorii au arătat că, cu cât eșantionul este mai mic, cu atât îmbunătățirea este mai semnificativă. Autorii au prezentat imagini reconstruite ale unei proteine din mușchi numită aldolază, care este relativ ușor de imaginat cu microscoapele cryo-EM convenționale, și ale hemoglobinei – o proteină care transportă oxigenul în sânge – care se află la limita inferioară pentru dispozitivele actuale.
„Pentru particula mai provocatoare, hemoglobina, am observat o îmbunătățire puternică cu laserul, dar pentru cea mai puțin provocatoare, aldolaza, îmbunătățirea este foarte mică, așa cum era de așteptat”, a declarat Jessie Zhang.
Müller a afirmat că acum, odată ce avantajele plăcii de fază laser au fost demonstrate clar, este entuziasmat de potențialul său de a rezolva problemele de bioimaging și mai complexe.
„Dacă ne uităm la toate proteinele dintr-un organism uman, acestea au dimensiuni variate. Toate aceste proteine pot reprezenta mecanisme de boală și ținte pentru medicamente. Problema este că, în medie, proteina umană este prea mică pentru a fi imaginată prin cryo-EM. Placa de fază laser ar putea umple o lacună imensă în cunoștințele noastre despre structurile proteice care nu pot fi procesate cu cryo-EM-ul de astăzi”, a adăugat Müller.
Müller a dedicat mai mult de 10 ani construirii unui prototip funcțional al plăcii de fază laser. Apoi, în 2021, Biohub a decis să mizeze pe această tehnologie și l-a sprijinit cu un grant, permițându-i să accelereze dezvoltarea, să achiziționeze un microscop electronic cryo de ultimă generație și să-l personalizeze pentru placa de fază laser.
În plus față de sprijinul acordat eforturilor lui Müller, Biohub a investit și mai mult, construind o versiune de nouă generație a plăcii de fază laser cu o complexitate dublă, având un sistem cu două lasere. Acest sistem este descris într-un nou preprint.
Dezvoltat în laboratorul de imagistică al Biohub din Redwood City, în colaborare cu UC Berkeley și parteneri din industrie, dispozitivul utilizează două fascicule laser orientate perpendicular între ele, fiecare în propria cavitate și funcționând la aproximativ jumătate din puterea necesară de sistemul cu cavitate unică utilizat în microscopul lui Müller. La o putere mai mică, componentele sunt mai puțin susceptibile de a se arde și aberațiile sunt reduse, facilitând operarea sistemului.
Conceptul unui sistem cu două lasere a fost propus pentru prima dată de Müller și colegii săi de la UC Berkeley acum doi ani într-o lucrare publicată recent.
Implementarea plăcii de fază laser a necesitat o combinație extraordinară de precizie, inginerie avansată și optică complexă pentru a genera cel mai intens laser de stare stabilă. În interiorul cavității, un fascicul laser este reflectat de aproape 10.000 de ori între două oglinzi concave, acumulând o intensitate de aproximativ 350 până la 400 de gigawați pe centimetru pătrat – o energie de 100 de milioane de ori mai intensă decât suprafața Soarelui, concentrată într-un punct de aproximativ 1/1000 din lățimea unui fir de păr uman.
Oglinzile care fac acest lucru posibil sunt, de asemenea, o realizare remarcabilă de inginerie. Fiecare oglindă trebuie să fie polizată la o „finisare la nivel atomic” – o rugozitate a suprafeței de mai puțin de un angstrom, aproximativ diametrul unui singur atom.
„Oglinzile trebuie să fie extrem de fără pierderi pentru a preveni topirea lor și, de fapt, sunt atât de fără pierderi încât abia se încălzesc, în ciuda bombardării cu un laser care ar putea tăia cu ușurință oțel de câțiva centimetri”, a spus Müller.
Precizia necesară pentru operarea instrumentului este de asemenea extrem de exigentă. Unghiul oglinzilor trebuie să fie aliniat la o sutime de grad pentru ca laserele să se reflecte eficient. În plus, fasciculul laser și fasciculul de electroni trebuie să fie aliniate la o distanță de 50 de nanometri – pe o undă staționară care are 500 de nanometri lățime – pentru a maximiza contrastul în timp ce
