Sistemul CRISPR ghidat de ADN vizează ARN și extinde Cas12 dincolo de editarea genelor
O platformă CRISPR ghidată de ADN ar putea face detectarea și controlul ARN mai stabile, scalabile și precise, deschizând noi direcții pentru diagnostice, inginerie a transcriptomului și cercetări terapeutice viitoare.
Într-un studiu recent publicat în revista Nature Biotechnology, cercetătorii au dezvoltat o nouă versiune a tehnologiei CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Sistemul folosește ghiduri pe bază de acid deoxiribonucleic (ADN) numite ΨDNA pentru a viza acidul ribonucleic (ARN) și poate fi asociat cu ghiduri convenționale de ARN CRISPR pentru a edita ADN folosind aceleași enzime Cas12. Această abordare îmbunătățește sistemele existente care folosesc ghiduri fragede de ARN.
Sistemul a detectat cu acuratețe ARN-ul virusului hepatitei C (HCV) în probe clinice după un flux de lucru bazat pe amplificare. Sistemele ghidate de ADN au ajutat de asemenea la controlul și modificarea moleculelor de ARN în interiorul celulelor, evidențiind potențialul pentru diagnostice ARN mai stabile, scalabile și precise.
CRISPR funcționează ca un instrument de „căutare și editare” extrem de precis pe care oamenii de știință îl pot programa pentru a găsi material genetic specific în celule. Diferite sisteme CRISPR pot edita ADN, viza ARN sau ajuta la detectarea virusurilor și bolilor cu o precizie ridicată. Aceste sisteme depind în general de ghiduri mici de ARN care direcționează proteinele CRISPR către ținta corectă. Totuși, aceste ghiduri sunt costisitoare de realizat și greu de stocat, deoarece se descompun ușor.
Cercetătorii au încercat să utilizeze ghiduri de ADN mai stabile, dar majoritatea sistemelor CRISPR nu funcționează bine cu ADN-ul singur, ceea ce a necesitat cercetări suplimentare.
În studiul actual, echipa a proiectat ΨDNA, un ghid pe bază de ADN care ajută sistemele Cas12 să găsească și să interacționeze cu ARN-ul, în timp ce ghidurile convenționale de ARN CRISPR pot fi încă utilizate pentru editarea ADN-ului.
Cercetătorii au testat diferite enzime CRISPR și au identificat două care au funcționat cel mai bine cu ΨDNA. Au perfecționat sistemul pentru a recunoaște diferite tipuri de ARN, inclusiv ARN-uri mici de reglare, ARN viral și ARN celular normal. Pentru a evalua eficacitatea, au realizat mai multe experimente de laborator pentru a studia interacțiunile de legare între componentele CRISPR și ARN.
Pentru a investiga dacă noua tehnologie ar putea funcționa în diagnosticele din lumea reală, cercetătorii au obținut probe de sânge de la persoane infectate cu HCV și de la indivizi sănătoși. Sistemul a fost testat utilizând asayuri pe bază de fluorescență după ce pașii de transcriere inversă, reacția de polimerizare în lanț și transcrierea T7 au generat ținte ARN pentru detectare. Ulterior, cercetătorii au evaluat activitatea intracelulară. Au introdus enzima CRISPR AsCas12a împreună cu ghiduri ΨDNA în celulele rinichilor embrionari umani (HEK) în laborator, ghidurile fiind concepute pentru a viza o moleculă fluorescentă roșie numită mCherry, care a acționat ca un marker vizibil. Blocarea cu succes a ARN-ului țintă ar reduce fluorescența roșie în celule.
După aceste evaluări, echipa a testat dacă aceeași enzimă CRISPR ar putea efectua simultan două sarcini. Acestea includeau reducerea unor molecule specifice de ARN și editarea ADN-ului. Această investigație ar clarifica dacă combinarea ΨDNA cu ghiduri CRISPR convenționale într-un sistem unic Cas12a ar putea să reducă simultan expresia genică la nivel de ARN și să editeze permanent genele la nivel de ADN.
ΨDNA a ajutat enzimele CRISPR să localizeze și să interacționeze cu țintele ARN. Noile ghiduri de ADN au funcționat deosebit de bine cu două enzime CRISPR, AsCas12a și Cas12i1. Acestea au demonstrat o acuratețe ridicată, activându-se doar în prezența țintei ARN corecte. Sistemul a rămas robust în peste 14 microARN-uri diferite testate. Designul optimizat a realizat o activitate puternică pe o lungime a ghidului de 16-28 nucleotide.
În plus față de acuratețea diagnostică, sistemul a demonstrat o sensibilitate ridicată. În probe clinice, care au implicat 20 de probe serice pozitive pentru HCV și 20 negative, sistemul a atins 100% acuratețe diagnostică. Limitele de detectare au variat între 1 și 10 picomolari. Platforma a rămas stabilă și eficientă în diferite condiții de laborator, sugerând promisiuni pentru aplicații de diagnosticare bazate pe ARN. Ghidul din regiunea necodificată 5′ a detectat toate probele pozitive din genotipurile HCV 1a și 1b, în timp ce ghidul E2 a fost selectiv pentru genotipul 1a.
Noul sistem a reușit să reducă efectiv activitatea genică relevantă pentru boli sau nedorite în celulele vii. Ghidurile ΨDNA au redus nivelurile ARN-ului țintă cu 50-70% în experimentele standard și cu 80-95% în sisteme celulare optimizate. Acestea au inclus mai multe linii celulare umane derivate din cancerul cervical (HeLa), cancerul hepatic (HepG2) și cancerul mamar (MCF-7). La nivel mecanic, sistemul a blocat mecanismul celular de sinteză a proteinelor și a declanșat căile proprii de degradare a ARN-ului ale celulelor pentru a distruge moleculele de ARN țintă, în loc să le taie direct.
Au existat mult mai puține efecte nedorite comparativ cu enzima de țintire ARN RfxCas13d, utilizată frecvent. Platforma a putut de asemenea să reducă simultan până la patru ținte ARN cu o eficiență de peste 70%. Aceste descoperiri evidențiază potențialul sistemului pentru specificitate îmbunătățită, deși siguranța și adecvarea terapeutică necesită validare preclinică suplimentară.
Ca exemplu de activitate simultană ARN și ADN, sistemul a editat gena CCR5 (C-C chemokine receptor 5) în timp ce reducea și nivelurile de ARN în aceleași celule. Această activitate duală a necesitat co-livrarea ΨDNA pentru țintirea ARN și a unei crRNA convenționale pentru editarea ADN-ului, folosind un singur efectoare Cas12a. Cercetătorii au adăugat de asemenea proteine, cum ar fi ribonuclease H1 (RNase H1) și methyltransferase-like protein 3 (METTL3). Aceste proteine au ajutat la distrugerea ARN-ului mai eficient sau la modificarea chimică a ARN-ului în moduri precise.
Constatările poziționează sistemele ghidate de ΨDNA ca alternative mai ieftine, mai stabile și mai versatile față de tehnologiile existente ghidate de ARN. Prin utilizarea ghidurilor de ADN care sunt mai ușor de pregătit și mai durabile, sistemul oferă o strategie practică pentru a îmbunătăți scalabilitatea aplicațiilor medicale și de cercetare. Deoarece tehnologia poate controla și modifica ARN-ul în plus față de editarea ADN-ului, aceasta ar putea avansa cercetările viitoare în terapia genică și abordările
