Un nou flux de lucru pentru imagistica multiplex accesibilă avansează cercetarea hepatică spațială
Tehnologiile de biologie spațială transformă cercetarea biomedicală modernă prin posibilitatea de a vizualiza organizarea celulară și interacțiunile din țesuturi intacte.
În hepatologie, acest aspect este deosebit de relevant, având în vedere că bolile hepatice, precum steatohepatita asociată disfuncției metabolice (MASH), colangiopatiile, fibroza și carcinomul hepatocelular, sunt influențate de microambienturi multicelulare extrem de heterogene. Totuși, adoptarea pe scară largă a tehnologiilor de imagistică multiplex este limitată de costuri ridicate, instrumentație specializată și fluxuri analitice complexe.
Un studiu recent publicat în eGastroenterology descrie un flux de lucru versatil pentru imunofluorescența multiplex (mIF), dezvoltat de Dr. Marlene S. Kohlhepp, Dr. Adrien Guillot și colegi, care își propune să depășească aceste obstacole. Autorii au creat o platformă integrată capabilă să analizeze țesuturi hepatice și sisteme inginerizate in vitro, bazându-se în principal pe microscopie de fluorescență convențională și instrumente computaționale open-source.
Platforma se bazează pe cicluri secvențiale de colorare cu anticorpi, imagistică și stripping de anticorpi. După fiecare rundă de imagistică, anticorpii sunt eliminați chimic printr-un protocol de stripping bazat pe β-mercaptoethanol/SDS, permițând aplicarea secvențială a altor markeri pe aceeași probă.
Utilizând această metodă, cercetătorii au demonstrat detectarea cu succes a aproximativ 10–15 markeri într-un singur specimen, păstrând în același timp arhitectura țesutului pe parcursul mai multor cicluri de colorare. Este important de menționat că fluxul de lucru a fost optimizat pentru secțiuni hepatice fixate în formalină și încorporate în parafină (FFPE), materialul standard utilizat în laboratoarele de patologie de rutină.
Studiul a arătat că metoda putea vizualiza simultan multiple populații celulare hepatice, inclusiv hepatocite, colangiocite, macrofage, celule endoteliale și celule stelate hepatice, permițând o caracterizare detaliată a microambienturilor hepatice.
O inovație majoră a studiului este extinderea imagisticii multiplex dincolo de secțiunile de țesut. Investigatori au adaptat protocolul pentru organoizi de colangiocite intrahepatice, culturi primare de celule hepatice și platforme avansate de tip liver-on-a-chip.
În organoizi, imagistica multiplex a permis evaluarea polarității epiteliale, proliferării și integrității joncțiunilor celulare prin analiza simultană a markerilor precum CK19, β-catenin, ZO-1, Ki67 și PCNA. În culturile primare de celule, metoda a permis caracterizarea spațială a hepatocitelor, macrofagelor, celulelor endoteliale și celulelor stelate cultivate în aceeași cameră.
Platforma a fost, de asemenea, implementată cu succes într-un sistem biliary niche-on-a-chip care conține multiple populații celulare hepatice. Aceasta demonstrează fezabilitatea aplicării fenotipării spațiale multidimensionale sistemelor microfiziologice inginerizate, un domeniu de importanță crescândă pentru modelarea bolilor și testarea medicamentelor.
Pentru a aborda povara computațională semnificativă generată de imagistica multiplex secvențială, autorii au dezvoltat CytoPrixm, un pachet software open-source pentru procesarea imaginilor.
CytoPrixm integrează mai multe funcții esențiale de preprocesare, inclusiv îmbinarea imaginilor, corectarea fundalului, alinierea canalelor și înregistrarea imaginilor bazate pe DAPI. Software-ul a fost conceput pentru a reduce volumul de muncă manuală și a îmbunătăți reproducibilitatea, minimizând în același timp necesitatea de expertiză avansată în programare.
Prin corelarea imagisticii experimentale multiplex cu o infrastructură computațională accesibilă, platforma își propune să faciliteze implementarea pe scară mai largă a abordărilor de fenotipare spațială în laboratoarele de cercetare.
Studiul subliniază importanța tot mai mare a analizelor rezolvate spațial în cercetarea bolilor hepatice. Imagistica multiplex poate oferi informații mecaniste despre recrutarea celulelor imune, reacția ductulară, fibrogeneza și remodelarea țesutului, susținând, de asemenea, validarea constatărilor derivate din seturi de date transcriptomice la nivel celular și spațial.
Este important de menționat că fluxul de lucru descris în acest studiu pune accent pe accesibilitate și scalabilitate, mai degrabă decât pe un număr maxim de markeri. Utilizând reactivi disponibili comercial, microscoape de fluorescență standard și software open-source, platforma poate reduce semnificativ barierele de intrare în cercetarea biologiei spațiale.
Pe măsură ce profilarea moleculară rezolvată spațial devine din ce în ce mai integrată în medicina translațională, platforme de imagistică adaptabile și eficiente din punct de vedere al costurilor, cum este aceasta, pot contribui la dezvoltarea patologiei digitale de generație următoare, strategiilor de stratificare a bolilor și hepatologiei de precizie.
