Un nou standard pentru genomul uman oferă o reprezentare aproape perfectă a ambelor copii parentale
Prin capturarea ambelor seturi de cromozomi moșteniți și atingerea regiunilor genomice care au fost omise de standardele convenționale, T2T-HG002 ar putea ajuta la tranziția de la identificarea variantelor bazate pe referință către genomuri personalizate complete.
Într-un studiu recent publicat în revista Cell, cercetătorii au dezvoltat un standard de referință aproape perfect pentru genomul uman diploid, destinat genomicii personalizate. Acest cadru de benchmark genomic include secvențe ale cromozomilor autosomali și ale celor sexuali, abordând limitările metodelor convenționale de benchmarking bazate pe referințe.
În timp ce abordările convenționale se bazează în general pe o secvență genomică existentă pentru identificarea variantelor, această nouă strategie oferă un benchmark telomere-la-telomere (T2T) care ajută la distincția dintre erorile de secvențiere și asamblare și variațiile genetice reale, evitând în același timp prejudecățile cauzate de erori, goluri și diferențe structurale în genomurile de referință externe. Această avansare ar putea ajuta cercetătorii să analizeze regiuni genomice anterior inaccesibile și, în cele din urmă, să sprijine o interpretare mai cuprinzătoare a variațiilor genetice asociate bolilor.
Abordările convenționale de resecuențiere întâmpină adesea dificultăți în detectarea modificărilor structurale și a regiunilor foarte variabile ale genomului legate de bolile genetice umane. Secvențierea cu citiri scurte se confruntă adesea cu dificultăți în a distinge regiunile duplicate foarte asemănătoare sau în a atribui variantele genetice copiilor parentali respective, în timp ce diferențele structurale dintre genomuri pot afecta și mai mult acuratețea. Sunt necesare strategii îmbunătățite pentru a spori precizia secvențierii genomice și a accelera medicina genomică personalizată.
În cadrul studiului, cercetătorii au dezvoltat un standard de benchmark T2T aproape perfect pentru evaluarea genomului uman diploid HG002, utilizat pe scară largă, în cadrul Proiectului Q100. Majoritatea datelor de secvențiere au fost obținute din culturi de celule limfoblastoide HG002. Spre deosebire de benchmark-urile convenționale care compară variantele cu un genom de referință, această abordare se bazează pe o secvență genomică diploidă aproape completă și foarte precisă ca standard de referință, separând erorile de secvențiere și asamblare de diferențele genetice reale dintre probă și un genom de referință extern. Această abordare de benchmarking genomic evită prejudecățile de referință și evaluează direct acuratețea inferențelor genomice și a haplotipurilor.
Cercetătorii au cartat genele și regiunile de ADN repetitiv din ambele copii parentale ale asamblării T2T-HG002, permițând o comparație directă între haplotipurile materne și paterne. De asemenea, au stabilit abordări pentru a evalua acuratețea secvențierii, a determina diferențele genetice rezolvate ale alelelor și a benchmark-ui asamblările genomice în raport cu secvența benchmark diploidă. Acest lucru a permis evaluarea acurateței la nivel de bază, rezolvarea haplotipurilor și a schimbărilor genomice la scară largă, abordând în același timp limitările metodelor anterioare de benchmarking al variantelor.
Genomul HG002 a fost asamblat utilizând date de secvențiere cu citiri lungi de la PacBio HiFi și Oxford Nanopore Technologies (ONT), completate cu secvențiere parentală Illumina pentru fazare și date Strand-seq și Hi-C pentru schelțuire. Validarea schelțuirii ADN-ului ribozomal (rDNA) a fost realizată prin hibridizare fluorescence in situ (FISH) și a ajutat la estimarea dimensiunilor aranjamentelor rDNA.
Echipa a îmbunătățit asamblarea T2T-HG002 prin runde succesive de corectare a erorilor și validare împotriva seturilor de date de secvențiere independente. Versiunea rezultată v1.1 a conținut 38.037 de corecții minore și 14,18 milioane de perechi de baze de regiuni de consens corectate. Acuratețea asamblării și fazarea au fost evaluate utilizând Merqury, în timp ce loci de imunoglobulină au fost validați manual. De asemenea, cercetătorii au dezvoltat software-ul GQC pentru a evalua asamblările în raport cu benchmark-ul și au comparat multiple asamblări HG002 generate utilizând diferite tehnologii de secvențiere pe parcursul a cinci ani.
Benchmarkul s-a dovedit a fi lipsit de erori detectabile în 99,4% din genomul diploid. Acesta a incorporat un supliment de 701,4 Mb (11,7%) de ADN autosomal cu înaltă încredere și 216,8 Mb de secvențe ale cromozomilor sexuali care lipseau din benchmark-ul anterior v4.2.1. Spre deosebire de secvențele de referință umane convenționale, care reprezintă de obicei un singur haplotip, T2T-HG002 conține ambele haplotipuri materne și paterne, oferind o reprezentare diploidă, cu două haplotipuri. Instrumentul GQC analizează aceste asamblări genomice, distingând între cele două copii parentale, permițând o evaluare mai precisă a regiunilor genomice complexe.
Avansurile în secvențierea T2T și reconstrucția genomică au îmbunătățit caracterizarea regiunilor genomice care au fost anterior dificil de rezolvat, inclusiv secvențe duplicate, clustere de gene extinse, regiuni de ADN satelit și structuri de ADN repetitiv. O comparație la nivelul întregului genom a relevat că asamblările de novo au recuperat cu 2 până la 7 procente mai multă secvență decât genomurile reconstruite din apelurile de variante, atingând o acuratețe de aproximativ zece ori mai mare la nivelul întregului genom.
După rafinament, scorul de calitate al asamblării a crescut de la Q63.1 în versiunea 0.7 la Q68.9 în versiunea 1.1. În aproximativ 2,66 Gb acoperite fiabil de ambele benchmark-uri, discrepanțele cu benchmark-ul mai vechi Genome in a Bottle (GIAB) au scăzut de la 5.972 la 219 variante, autorii atribuind aproape toate diferențele rămase erorilor din benchmark-ul mai vechi.
Annotarea HG002 a identificat 13 gene autosomale prezente doar pe haplotipul matern și 12 gene prezente doar pe haplotipul patern, inclusiv gene cu număr variabil de copii, cum ar fi fosfataza duală de specificitate 22 (DUSP22), factorul de complement H-relat 1 (CFHR1), factorul de complement H-relat 3 (CFHR3), transferaza glutation-S theta 1 (GSTT1) și transferaza glutation-S mu 1 (GSTM1). Cercetătorii au integrat, de asemenea, seturi de date genomice funcționale cu citiri lungi, inclusiv metilarea, accesibilitatea cromatinică și profilele transcriptomice, oferind o acoperire la nivelul întregului genom pe ambele haplotipuri.
Benchmarking-ul asamblărilor anterioare HG002 a arătat îmbunătățiri progresive în completitudine și reduceri ale erorilor de substituție, indel și schimbare de fază, T2T-HG002 oferind adevărul de referință pentru comparație. Genomurile construite din variante au reprezentat o fracție mai mică din
