Cercetătorii japonezi utilizează nanoparticule de argint pentru a crește eficiența asamblării ADN-ului de până la cinci ori
ADN-ul constă din lanțuri moleculare lungi care poartă instrucțiunile genetice necesare vieții.
În ingineria genetică, cercetătorii taie ADN-ul în locuri atent selectate și conectează acele fragmente cu alte secvențe de ADN. Acest proces susține o gamă largă de aplicații, inclusiv îmbunătățirea creșterii culturilor, tratamente pentru boli genetice și crearea de modele animale utilizate în dezvoltarea de medicamente.
Pentru a conecta eficient bucăți scurte de ADN, oamenii de știință se bazează pe secvențe suprapuse numite capete lipicioase. Aceste secțiuni expuse ajută fragmentele de ADN să se lipească unele de altele. Totuși, producerea capetelor lipicioase corecte necesită o tăiere extrem de precisă în locații specifice, ceva ce tehnologiile existente nu reușesc întotdeauna să gestioneze bine.
Cercetătorii din Japonia au dezvoltat acum o metodă care folosește nanoparticule de argint pentru a tăia și reconecta ADN-ul în locații țintite. Tehnica a generat eficiențe de asamblare a ADN-ului de două până la cinci ori mai mari decât cele obținute cu metodele convenționale bazate pe enzime de restricție. Rezultatele au fost publicate în Nucleic Acids Research.
Limitările metodelor convenționale de asamblare a ADN-ului sunt notabile. Metodele standard pentru asamblarea moleculelor lungi de ADN utilizează, de obicei, enzime de restricție pentru a efectua tăieturi și T4 ADN ligază pentru a conecta fragmentele rezultate. Însă enzimele de restricție pot recunoaște și tăia doar anumite secvențe de ADN. De asemenea, acestea tind să producă capete lipicioase relativ scurte, ceea ce poate reduce eficiența procesului de unire.
În căutarea unei alternative, o echipă condusă de Hiroshi Abe și Masahito Inagaki de la Universitatea Nagoya, în colaborare cu Natsuhisa Oka de la Universitatea Gifu, a investigat dacă reacțiile chimice ar putea fi utilizate pentru a tăia ADN-ul în locații selectate, fără a se baza pe enzimele de restricție.
Cercetătorii au revizuit o reacție raportată pentru prima dată între 1990 și 1992, în care ionii de argint tăiau ADN-ul modificat cu tiol 3′- în locații specifice. Aceștia au testat dacă această reacție ar putea fi folosită pentru a crea capete lipicioase utile. Ionii de argint s-au dovedit eficienți în a tăia ADN-ul, dar au provocat și atașări nespecifice, cauzând precipitare. Drept urmare, doar aproximativ 14% din ADN a putut fi recuperat, o cantitate insuficientă pentru aplicații practice.
Următoarea etapă a echipei a fost înlocuirea ionilor de argint cu nanoparticule de argint. Cercetătorii au considerat că nanoparticulele ar putea fi separate din amestecul de reacție prin centrifugare, facilitând astfel recuperarea ADN-ului ulterior.
Experimentele inițiale au arătat că eficiența cleavării ADN-ului a ajuns la aproximativ 50% la 70°C și aproape 100% la 95°C în decurs de două ore. Totuși, aceste temperaturi pot deteriora moleculele lungi de ADN, creând o altă barieră pentru utilizarea practică.
Pentru a rezolva această problemă, cercetătorii au acoperit nanoparticulele cu polietilen glicol (PEG), un polimer solubil în apă, pentru a le îmbunătăți stabilitatea și dispersia. Acest strat a crescut eficiența cleavării ADN-ului de la 36% fără PEG la 92% cu PEG la 37°C pe parcursul a 31 de ore. „În cele din urmă, am optimizat condițiile la un nivel practic și, la temperaturi ambientale, am realizat o eficiență de cleavare modificată cu PEG de peste 91% la 50°C în doar una sau două ore”, a declarat Inagaki, autorul principal al studiului.
Abordarea nanoparticulelor a oferit un alt avantaj important. Fragmentele de ADN nedorite au rămas atașate de suprafețele nanoparticulelor, în timp ce fragmentele dorite, care conțineau capete lipicioase, au rămas în soluție. Acest efect de purificare încorporat a crescut rata finală de recuperare a ADN-ului de la 14% la 98%.
Nanoparticulele de argint au permis, de asemenea, cercetătorilor să producă fragmente de ADN cu capete lipicioase de 8 baze, care sunt dificile de generat folosind enzimele de restricție convenționale. Atunci când oamenii de știință au folosit T4 ADN ligază pentru a conecta aceste fragmente, eficiența unirii a fost de aproximativ două ori mai mare decât în cazul metodelor tradiționale.
Îmbunătățirea a devenit și mai mare cu suprapunerile mai lungi. Folosind o suprapunere de 18 baze, cercetătorii au realizat o eficiență de unire de 44%. Comparativ, o suprapunere convențională de 4 baze a produs o eficiență de doar 8%, oferind noilor abordări un avantaj de cinci ori.
Pentru a testa dacă metoda ar putea funcționa într-un mediu biologic practic, echipa a asamblat un fragment de ADN care codifică proteina fluorescentă verde (GFP). Aceștia au introdus apoi ADN-ul asamblat în celulele umane HeLa. Celulele au reușit să exprime GFP, confirmând că ADN-ul a fost asamblat corect.
Inagaki a comentat: „Considerăm că această tehnologie va fi utilă pentru sintetizarea ADN-ului genomic, având numeroase aplicații posibile în domenii precum stabilirea bibliotecilor de mARN pentru vaccinurile împotriva cancerului și terapia genică, precum și dezvoltarea de medicamente proteice artificiale și culturi genomice.”
Cercetătorii doresc acum să determine dacă tehnica poate depăși conexiunea a doar două fragmente de ADN simultan. De asemenea, acesta a explicat următorul pas: „Am demonstrat că două fragmente de ADN pot fi unite. Acum, trebuie să confirmăm dacă mai multe fragmente pot fi unite simultan – un pas esențial pentru construirea ADN-ului la scară genomică.”
