Fibrele amiloide facilitează transportul ARN de către spermatozoizi la embrionii de șoareci
O enigmă de lungă durată legată de mesajele genetice transportate de spermatozoizi a condus cercetătorii să investigheze un component neașteptat al fluidului seminal și rolul său posibil în dezvoltarea timpurie a embrionilor.
Un studiu recent publicat în revista Molecular Cell sugerează că fibrilele amiloide din fluidul seminal pot facilita absorbția acidului ribonucleic extracelular (ARN) de către spermatozoizii mamiferelor, precum și livrarea acestuia către zigot în timpul fertilizării. Experimentele realizate cu fibrile sintetice au demonstrat, de asemenea, traducerea ARN-ului în embrioni de șoareci, sugerând o abordare posibilă pentru livrarea ARN-ului non-viral în timpul fertilizării.
Cercetările anterioare sugerează că ARN-ul spermatozoizilor ar putea contribui la dezvoltarea embrionară. Dieta, stresul și expunerile de mediu au fost, de asemenea, corelate cu modificări ale ARN-ului spermatozoizilor, care ar putea influența generațiile următoare. Pentru ca această transferare să se producă, ARN-ul din fluidul seminal trebuie să ajungă la spermatozoizi și să rămână disponibil pentru livrare după fertilizare. Înțelegerea modului în care acest lucru se întâmplă ar putea oferi indicii despre o cale prin care influențele de mediu pot afecta dezvoltarea timpurie a embrionilor.
În cadrul studiului actual, cercetătorii au utilizat tomografia crio-electronică și microscopie electronică de volum, alături de imagistica fluorescenței în celule vii, pentru a investiga transferul de ARN din fluidul seminal la spermatozoizi prin intermediul fibrilelor amiloide. Au fost folosite teste biofizice, experimente de fertilizare in vitro cu șoareci, secvențiere ARN și spectrometrie de masă pentru a examina transferul fibrilelor către embrioni și a analiza proteinele din spermatozoizi și embrioni.
Cercetătorii au folosit un fragment sintetic al fosfatazei acide prostatice umane pentru a studia formarea fibrilelor amiloide. De asemenea, au investigat dacă acest fragment poate suferi separație în faze lichide, având în vedere regiunile sale dezordonate. Au fost utilizate experimente de microscopie confocală pentru a evalua colocalizarea PAP-ARN, iar experimentele de fotobleaching au evaluat lichiditatea condensatelor. Testele cinetice și microscopie cu lumină au fost folosite pentru a urmări tranzițiile între fazele lichide și solide.
Pentru a evalua rolul proteinelor de suprafață ale spermatozoizilor în absorbția fibrilelor, celulele spermatozoizilor umani au fost tratate cu tripsină, înainte de a fi incubate cu fibrilele conținând PAP. Sortarea celulară activată de fluorescență a fost utilizată pentru a evalua absorbția fibrilelor în aceste celule. În experimente separate cu spermatozoizi bovini, au fost efectuate microscopii electronice correlative și tomografii electronice pentru a evalua internalizarea fibrilelor.
În experimentele de fertilizare in vitro cu șoareci, fibrilele PAP au crescut livrarea ARN-ului HIV-2 TAR etichetat izotopic către embrioni în stadiul de două celule. Când spermatozoizii au fost expuși la ARN-mesager EGFP cu fibrile PAP, semnalul de spectrometrie de masă pentru proteina EGFP în embrioni a fost de cel puțin zece ori mai mare cu fibrile decât fără, indicând că ARN-ul transferat a rămas disponibil pentru traducere.
ARN-ul a determinat fragmentul PAP să se separe în faze și să formeze fibrile amiloide. Testele cinetice au demonstrat că ARN-ul a scurtat faza de întârziere și a accelerat tranziția de la monomeri la fibrile. Testele de mobilitate electroforetică au oferit dovezi ale legării ARN-ului la structurile fibrilare formate de PAP. Microscopie crio-electronică a fracțiilor purificate insolubile în detergent din fluidul seminal uman a identificat fibrile subțiri cu un diametru de aproximativ 70 Å, cu o creștere axială de 4,7 Å, caracteristice fibrilelor amiloide. O analiză dot blot utilizând un anticorp IgM specific pentru conformație a oferit dovezi suplimentare ale structurilor amiloide în fracțiile izolate.
Separarea fazelor PAP-ARN a persistat în plasma seminală umană și în soluții cu NaCl între 100–200 mM. La concentrații fiziologice ale peptidei de până la 60 μM, s-au format doar câteva condensate. Concentrațiile mai mari de sare și tratamentul cu RNază A al amestecurilor de ARN polyU și polyC au redus separarea fazelor. De asemenea, PAP bovin și murin a separat fazele cu ARN, indicând interacțiuni conservate între specii. Aceste interacțiuni ar putea explica modul în care ARN-ul se asociază cu fibrilele amiloide din fluidul seminal.
PAP și ARN s-au colocalizat în picături lichide, care au crescut în dimensiune pe măsură ce concentrațiile de PAP sau ARN au crescut. Lungimea ARN-ului a influențat, de asemenea, cinetica formării fibrilelor amiloide. Fluorescența Thioflavin T a apărut în agregatele de picături după 32–48 de ore și a atins un platou după 72 de ore, indicând formarea fibrilelor amiloide mature. Microscopie crio-electronică a relevat fibrile predominant plate, dublete în preparatele sintetice de PAP, în timp ce ARN-ul polyU a accelerat formarea fibrilelor. Descoperirile sugerează că separarea fazelor indusă de ARN precede formarea fibrilelor amiloide PAP.
Secvențierea specializată a ARN-ului a arătat că fragmentele derivate din ARN transfer RNA (tRNA) predominau printre ARN-urile mici annotate în fracțiile îmbogățite cu amiloid izolate din fluidul seminal uman. Dintre ARN-urile annotate cu dimensiuni între 35–40 nucleotide, cele mai multe erau derivate din tRNA. Tomografia crio-electronică a arătat că spermatozoizii mamiferelor au preluat fibrilele amiloide sintetice PAP.
Fibrilele au intrat în spermatozoizii bovini prin piesa mediană în decurs de cinci minute, cu o internalizare și acumulare mai mare în interiorul celulelor după 45 de minute. Tratamentul cu tripsină a redus proporția spermatozoizilor umani vii cu fibrile internalizate de la 2,44% la 0,30%, sugerând că absorbția depinde de proteinele de suprafață.
Autorii au avertizat că diferențele între imagistica fluorescenței și citometria de flux au complicat determinarea ratei de absorbție. Imagistica directă a detectat fibrile amiloide în aproximativ o cincime dintre embrionii în stadiul de două celule produși folosind spermatozoizi expuși acestora înainte de fertilizare. În vitro, clusterina a promovat eliberarea ARN-ului din fibrilele sintetice PAP. Chaperonele moleculare, inclusiv Hsc70 și clusterina, au fost de asemenea identificate în fracția insolubilă a fluidului seminal uman.
Aceste descoperiri sugerează că fibrilele amiloide funcționale din fluidul seminal pot lega ARN-ul, protejându-l potențial de degradare, facilitând absorbția sa de către spermatozoizi și livrarea către zigot în timpul fertilizării. Experimentele in vitro sugerează că clusterina ar putea reglementa eliberarea ARN-ului, în timp ce fibrilele PAP par să lege diverse specii de ARN prin interacțiuni electrostatice predominant nespecifice.
