Redesignul AI facilitează evoluția enzimelor dincolo de limitele naturale
Prin stabilizarea punctelor de plecare ale enzimelor înainte de evoluție, cercetătorii au deschis noi rute mutaționale pentru ingineria proteazelor foarte specifice, inclusiv candidați vizând proteinele asociate cu boli.
Într-un studiu recent publicat în revista Nature, cercetătorii au stabilit un flux de lucru practic, utilizând modele de proteaze botulinice, în care redesignul bazat pe inteligență artificială (IA) al secvențelor proteice a îmbunătățit punctele de plecare și rezultatele pentru evoluția direcționată automatizată, ajutând la atenuarea compromisurilor între stabilitate și activitate care pot constrânge ingineria enzimelor.
Studiul a folosit un model de design al secvenței proteice bazat pe învățare profundă numit „ProteinMPNN” împreună cu metoda computațională de stabilizare a proteinelor denumită „PROSS” pentru a genera variante inițiale stabilizate ale proteazelor botulinice înainte de a le supune evoluției continue asistate de fag (PACE).
Un aspect notabil al studiului a fost că, în campaniile de evoluție BoNT/E, punctele de plecare redesignate au generat rezultate superioare celor ale enzimelor de tip wild-type (WT), adaptându-se mai rapid și având acces la un spațiu mutațional activ foarte ridicat, care s-a dovedit a fi nefuncțional în fundalul WT BoNT/E.
Un aspect crucial a fost că, atunci când au fost evoluate pentru a cleava ataxina-2 umană, o proteină implicată în neurodegenerare, o variantă de protează redesignată prin IA a atins o specificitate de peste 79 de ori mai mare pentru substratul ataxina-2 selectat comparativ cu cea mai bună enzimă evoluată WT, demonstrând o divergență de 16% în secvență față de cadrul proteic natural și subliniind beneficiile ingineriei proteice asistate de IA și dezvoltarea potențială a enzimelor terapeutice.
De la începuturile selecției selective, acum câteva mii de ani, oamenii au încercat să modeleze biosfera pentru a se adapta nevoilor lor. Evoluția direcționată a enzimelor naturale este o extensie relativ recentă a acestei idei în laborator, care a ajutat deja la furnizarea de soluții fezabile pentru aplicații biomedicale, terapeutice și de mediu.
Cu toate acestea, pe măsură ce căutarea de enzime noi, mai eficiente continuă, un număr tot mai mare de cercetări subliniază că campaniile evoluționare convenționale pot întâmpina o limitare critică. Aceste campanii sunt adesea bazate pe screeningul proteinelor de tip wild-type, care pot fi constrânse de stabilitatea biophysicală marginală.
Deoarece multe mutații care conferă funcții catalitice noi sau specificități de substrat non-native pot fi termodinamic destabilizatoare, evoluția proteinelor pierde frecvent integritatea structurală înainte de a atinge activitatea optimă. Acest aspect a generat interesul pentru utilizarea instrumentelor IA în sprijinul ingineriei proteinelor terapeutice.
Instrumentele computaționale precum ProteinMPNN pot genera secvențe proteice prezise pentru a păstra o structură dorită în timp ce se alterează o mare parte din secvența aminoacizilor, dar dacă enzimele redesignate prin IA posedă o evoluabilitate superioară în fața diverselor presiuni de selecție și pe peisaje de fitness complexe a rămas neclar.
Studiul de față a avut ca scop abordarea acestei lacune de cunoștințe prin integrarea redesignului secvențelor IA cu platformele de evoluție continuă de înaltă capacitate. În primul rând, studiul a utilizat instrumentele ProteinMPNN și PROSS pentru a redesigna domeniile catalitice BoNT/E, BoNT/F și BoNT/X.
Aceste domenii catalitice redesignate au fost concepute pentru a incorpora constrângeri de distanță structurală (10–18 Å de la substrat și ionii de zinc catalitici) și praguri de conservare a aliniamentului secvenței multiple (MSA) (30–60%).
Potențialul evolutiv al acestor enzime redesignate a fost evaluat folosind 44 de campanii de evoluție continuă paralele pe o platformă automatizată eVOLVER. Aici, proteazele wild-type și redesignate BoNT/E au fost provocate să acționeze împotriva unui panel de substraturi SNAP25 modificate de dificultate crescătoare (în special substraturile 415, 413 și 412).
În final, fluxul de lucru a fost aplicat pentru a reprogama specificitatea BoNT/E către ataxina-2 umană (reziduurile 1181–1201), o proteină implicată în neurodegenerare, inclusiv SLA.
Caracterizarea inițială a 74 de designuri BoNT/E ProteinMPNN a arătat că 78% au păstrat activitatea catalitică. Varianta redesignată cea mai performantă (D1-D3) a demonstrat eficiențe catalitice de 1,7 până la 2,8 ori mai mari decât enzima de tip wild-type. În special, D2 a atins cea mai mare eficiență catalitică (kcat/KM), de până la 310 mM−¹s−¹ comparativ cu 110 mM−¹s−¹ pentru WT BoNT/E.
Enzimele redesignate au demonstrat, de asemenea, o stabilitate termică semnificativ superioară, cu temperaturi de topire ajungând până la 59,5°C. Aceste beneficii numerice s-au tradus bine în practica experimentală. Studiul a arătat că, prin combinarea redesignurilor ProteinMPNN cu mutațiile provenite de la o protează BoNT/E care cleva PTEN evoluată anterior prin PACE, s-a crescut expresia celulară HEK293T cu peste 24 de ori pentru D2 și D3, în timp ce produsele de cleavare PTEN au crescut cu 4,5 ori și, respectiv, 3,9 ori.
În plus, în campaniile de evoluție directă care au testat efectele enzimelor redesignate față de omologii lor de tip wild-type, punctele de plecare redesignate au generat constant rezultate superioare. Cel mai important, în revizuirea rezultatelor experimentelor efectuate împotriva substratului cel mai provocator, 412, evoluțiile WT au eșuat în 50% din lagune, în timp ce toate lagunele redesignate au avut succes.
Proteazele redesignate au fost, de asemenea, capabile să tolereze mutațiile destabilizatoare (de exemplu, K225E) care conferă o funcție catalitică ridicată, dar care nu au provocat nicio activitate detectabilă atunci când au fost graftate în fundalul WT. În plus, un redesign cu o viteză inițială kinetică afectată (D4; 20 de ori mai lentă decât WT) a evoluat o activitate finală mai mare decât WT, susținând ideea că stabilitatea punctului de plecare poate extinde potențialul evolutiv.
În final, campaniile de evoluție pentru ataxina-2 au relevat că, chiar și cea mai bună protează evoluată D3 [D3(428)2] la cea mai mare concentrație testată (50 µM) nu a demonstrat nicio cleavare detectabilă a substratului natural SNAP25 într-un test FRET.
Acest studiu stabilește că asocierea redesignului secvenței IA cu evoluția continuă automatizată poate, în modelele de proteaze BoNT, ajuta la atenuarea compromisului clasic între stabilitatea enzimelor și dobândirea de noi funcții catalitice. Prin extinderea spațiului mutațional accesibil, punctele de plecare redesignate au permis evoluția unor activități
