Nanovesiculele derivate din cannabis au arătat potențial antitumoral timpuriu la șoareci
O cercetare recentă a urmărit modul în care nanovesiculele produse de rădăcinile părului de Cannabis sativa interacționează cu principalele căi de semnalizare imunitară, testând totodată stabilitatea acestora pentru administrarea orală.
Un studiu publicat în revista NPJ Science of Food a dezvoltat un sistem de cultură a rădăcinilor părului de Cannabis sativa și a izolat nanovesicule (CH-PDNVs) din aceste rădăcini, permițând o investigație detaliată a proprietăților lor fizico-chimice și a potențialului imunomodulator.
Cultura de țesuturi vegetale permite producția precisă și sterilă de biomateriale vegetale. Pe lângă aplicațiile tradiționale în propagare și conservare genetică, această metodă oferă o platformă sustenabilă pentru generarea de molecule bioactive pentru utilizare în alimentație, nutraceutice și biomedical.
Sistemele de rădăcini păr, stabilite prin transformare mediată de Rhizobium rhizogenes, prezintă o creștere rapidă, stabilitate genetică și păstrarea căilor metabolice complexe. Integrarea plasmidului Ri T-DNA în genomul gazdei produce „rădăcini păr” auto-sustenabile, capabile de sinteză continuă a metabolitelor.
Deși culturile de rădăcini păr sunt producători consacrați de metabolite specializate, potențialul lor ca surse de nanomateriale funcționale rămâne subutilizat. Majoritatea cercetărilor se concentrează pe randamentele de biomasă și metabolite secundare, cu explorări limitate ale aplicațiilor biomedicale ale fracțiunilor lor vesiculare la scară nanometrică.
Nanovesiculele derivate din plante (PDNVs) emergente se prezintă ca nanomateriale naturale care facilitează comunicarea intercelulară prin transferul de lipide, proteine, acizi nucleici și metabolite. Compoziția biochimică a PDNV-urilor reflectă starea fiziologică și metabolică a țesutului sursă, influențând proprietăți precum activitatea antiinflamatoare, antioxidantă și imunomodulatorie.
Variabilitatea mediului reprezintă o provocare pentru producția de PDNV-uri din plante cultivate în câmp, afectând consistența profilurilor biochimice. Deși platformele de cultură a țesuturilor, cum ar fi culturile de calus induse hormonal și culturile de rădăcini adventive, au fost explorate pentru producția de PDNV-uri, acestea pot avea limitări în ceea ce privește stabilitatea genetică și metabolică comparativ cu sistemele de rădăcini păr. Dezvoltarea unor platforme de producție bazate pe rădăcini păr reproducibile ar putea ajuta la generarea de bionanomateriale derivate din plante cu atribute funcționale fiabile.
A fost stabilit un sistem de cultură a rădăcinilor păr fără sol utilizând C. sativa prin transformare mediată de R. rhizogenes. Liniile transgenice au fost confirmate prin analiza PCR vizând genele rol, iar absența amplificării virD a indicat lipsa contaminării reziduale cu R. rhizogenes. Linia 5 a fost selectată pentru studii suplimentare datorită caracteristicilor superioare de creștere și a fost extinsă în cultură lichidă pentru producția de CH-PDNV.
CH-PDNVs au fost izolate prin omogenizare și centrifugare diferențială, urmate de filtrare prin flux tangential și ultracentrifugare cu iodixanol. Vesiculele au avut un diametru mediu de aproximativ 113 nm și un potențial zeta de -22,6 mV, demonstrând proprietăți coloidale stabile. Microscopia electronică și analiza markerilor au confirmat morfologia lor sferică intactă și originea specifică din plante. Nivelurile de endotoxină au fost scăzute, iar markerul bacterian OmpA nu a fost detectat, susținând concluzia unei contaminări bacteriene reduse în preparat.
Profilarea metabolomică a arătat că CH-PDNVs posedă o compoziție chimică diversificată, inclusiv molecule mici asociate aminoacizilor, carbohidraților și lipidelor. Maparea căilor bazate pe KEGG a corelat metabolitele anotate cu metabolismul argininei și prolinei, interconversiile pentozelor și glucuronatelor și metabolismul acizilor grași, susținând prezența unor semnături metabolice diverse de carbon și lipide primare.
CH-PDNVs au menținut dimensiunea particulelor, distribuția dimensiunii și potențialul zeta în condițiile de pH, enzimatic, temperatură și ser, inclusiv expunerea la enzime relevante pentru digestie.
CH-PDNVs au demonstrat activitate imunomodulatorie in vitro și in vivo, iar efectele lor antitumorale au fost testate pe șoareci. În experimentele de cultură celulară, CH-PDNVs au indus o maturare pronunțată a celulelor dendritice (DC), evidențiată prin creșterea expresiei suprafeței moleculelor de co-stimulare CD80 și CD86, precum și a complexelor de histocompatibilitate majore (MHC) clasele I și II.
Funcțional, DC-urile mature au produs niveluri semnificativ mai mari de citokine pro-inflamatorii, inclusiv factorul de necroză tumorală-alfa (TNF-α), interleukina-6 (IL-6), interleukina-1 beta (IL-1β) și interleukina-12p70 (IL-12p70), în timp ce citokina antiinflamatorie interleukina-10 (IL-10) a crescut doar moderat. Tratamentul cu CH-PDNV nu a indus citotoxicitate și nu a redus viabilitatea celulelor dendritice derivate din măduva osoasă (BMDCs) la concentrații de până la 20 μg/mL, iar efectele sale nu au fost atribuite endotoxinelor reziduale, deoarece răspunsurile au persistat chiar și în prezența agenților neutralizatori de endotoxină.
DC-urile tratate cu CH-PDNV au arătat o reducere a captării antigenului, consistentă cu tranziția lor către un fenotip matur, imunostimulator, capabil să activeze eficient celulele T. Atunci când au fost co-cultivate cu celule T, aceste DC-uri au promovat puternic proliferarea celulelor T CD4+ helper și a celulelor T CD8+ citotoxice. Celulele T primite de DC-uri mature cu CH-PDNV s-au polarizat predominant către fenotipurile T helper 1 (Th1) și T helper 17 (Th17), așa cum a fost indicat de secreția crescută de interferon-gamma (IFN-γ) și interleukina-17A (IL-17A), cu inducție minimă a T helper 2 (Th2; IL-5). Aceste descoperiri indică activarea asociată Th1 și Th17 în modelul de co-cultură.
Din punct de vedere mecanistic, maturarea DC-urilor induse de CH-PDNV a implicat semnalizarea asociată TLR2 și TLR4, iar contribuția relativă a fiecărui receptor a variat în funcție de citokinele și răspunsurile de co-stimulare. Deficiența TLR4 a produs o reducere mai mare a mai multor răspunsuri citokinice și co-stimulatoare, în timp ce deficiențele TLR2 și TLR4 au afectat expresia MHC și semnalizarea MAPK; efectele asupra semnalizării NF-κB au variat de asemenea în funcție de receptor. Experimentele de knockout nu au stabilit interacțiuni fizice directe între CH-PDNVs și oricare receptor. CH-PDNVs au fost mai
