Microscopia Deep UV permite caracterizarea celulelor T fără marcaje
O echipă de cercetători de la Georgia Institute of Technology și Emory University a dezvoltat o metodă de microscopie în ultraviolete profunde (UV) care permite evaluarea rapidă a viabilității celulelor T, stării de activare și subtipului – toate acestea fără a necesita marcaje fluorescente sau distrugerea celulelor.
Lucrarea, publicată în BME Frontiers, oferă o abordare transformatoare pentru monitorizarea imunității și dezvoltarea terapiilor celulare.
Celulele T au un rol esențial în sistemul imunitar, iar caracterizarea lor este crucială pentru a înțelege funcția imunitară, a urmări progresia bolii și a optimiza terapiile celulare adoptive, precum CAR-T. Totuși, metodele actuale standard, precum citometria de flux, necesită etichetare fluorescentă, echipamente costisitoare și, de obicei, distrug celulele în timpul măsurării. Aceste limitări afectează monitorizarea în timp real și studiile longitudinale ale culturilor de celule vii.
Noul demers utilizează imagini statice în UV profund, capturate la 255 nm, o lungime de undă puternic absorbită de acizii nucleici, pentru a genera imagini cu contrast ridicat ale celulelor T vii, fără utilizarea unor coloranți externi. Prin antrenarea unei rețele neuronale reziduale personalizate pe imagini provenite de la cinci donatori umani, cercetătorii au obținut o acuratețe ridicată în clasificarea celulelor T în trei categorii: activate, moarte și quiescente (naive sau în faza de contracție). Predicțiile modelului au arătat o corespondență excelentă cu citometria de flux, având un R² > 0,97 atât pentru viabilitate, cât și pentru procentajul de activare.
O sarcină mai complexă este subtiparea celulelor T helper CD4⁺ de celulele T citotoxice CD8⁺. Caracteristicile morfologice statice s-au dovedit insuficiente. Pentru a depăși această provocare, echipa a recurs la imagistica dinamică în UV profund, obținând serii de timp de 500 de cadre la aproximativ 8 Hz. Prin analiza fluctuațiilor temporale pixel cu pixel în domeniul frecvenței utilizând analiza phasor și ajustarea puterii, au cuantificat activitatea intracelulară. O a doua rețea neurală, alimentată cu intrări din patru canale (absorbție UV, phasor g, phasor s și panta puterii), a distins celulele T CD4⁺ de celulele T CD8⁺ cu o acuratețe de aproximativ 90%.
Este important de menționat că celulele T CD4⁺ au demonstrat o activitate dinamică intracelulară semnificativ mai mare decât celulele T CD8⁺, ceea ce este în concordanță cu diferențele metabolice cunoscute – celulele CD4⁺ se bazează mai mult pe glicoliză și fosforilare oxidativă și au mai multe mitocondrii citoplasmatice. Imaginile pseudocolorate au arătat că diferența de activitate este localizată în citoplasmă, nu în nucleu, susținând și mai mult legătura cu mecanismele metabolice.
Potențialul aplicațiilor microscopiei în UV profund este vast, acoperind cercetarea în imunologie, monitorizarea imunității și dezvoltarea terapiilor celulare emergente. Simplitatea, rapiditatea și rezoluția înaltă a acestei metode o fac un instrument de neprețuit pentru optimizarea terapiilor celulare adoptive, urmărirea progresiei bolii și îmbunătățirea înțelegerii fundamentale a funcției imunității.
