Blocarea oxidului nitric inhibă creșterea tumorilor în neuroblastomul pediatric agresiv
Neuroblastomul, o formă de cancer pediatric, își are originea înainte de naștere, când celulele din creasta neurală, care ar fi trebuit să se dezvolte în țesut adrenal sau ganglioni simpatici, iau o direcție greșită, rezultând o malignitate care poate să nu se manifeste timp de luni întregi.
Acest tip de cancer reprezintă aproximativ 28% din toate cazurile de cancer diagnosticate la sugari în Europa și Statele Unite. În forma sa cea mai benignă, neuroblastomul se poate regresa de la sine, dar în forma sa cea mai severă, metastazizează rapid, ceea ce determină oncologii să folosească termeni pe care ar prefera să nu-i utilizeze în fața părinților. Neuroblastomul de risc înalt are o rată de supraviețuire de aproximativ 40% în cinci ani, un număr care a rămas constant în ultimii 30 de ani.
Recent, un studiu publicat în revista științifică Brain Medicine a oferit o explicație mecanistică pentru modul în care acest cancer se menține, precum și o modalitate de a interveni.
Oxidul nitric este una dintre cele mai vechi molecule semnalizatoare din biologie. Acesta dilată vasele de sânge și transportă mesaje între neuroni. La concentrații fiziologice, este esențial, dar la concentrații crescute devine reactiv, generând specii de azot care modifică chimic proteinele printr-un proces numit S-nitrozilare. Această modificare a fost implicată în toate etapele progresiei cancerului.
Relația dintre oxidul nitric și tumori este complexă. Concentrațiile foarte mari pot deteriora ADN-ul și pot declanșa apoptoza, în timp ce nivelurile mai scăzute, susținute, par să aibă efectul opus, promovând supraviețuirea și metastaza. Prof. Haitham Amal și colegii săi de la Universitatea Hebrew din Ierusalim au demonstrat anterior că oxidul nitric stimulează progresia glioblastomului. Întrebarea care rămânea era dacă aceeași enzimă, sinteza oxidului nitric neuronal, oferea un serviciu similar pentru neuroblastom și, dacă da, prin ce cale downstream.
Răspunsul s-a dovedit a fi mTOR.
Echipa a atacat nNOS din două direcții. Au tratat celulele umane de neuroblastom SH-SY5Y cu BA-101, un inhibitor farmacologic selectiv, la o concentrație de 100 μM timp de 24 de ore. Separat, au silențiat gena nNOS cu ajutorul ARN-ului mic de interferență. Logica era clară: dacă un medicament și un instrument genetic produc același rezultat, se observă un fenomen biologic, nu un zgomot farmacologic.
Au obținut același rezultat.
BA-101 a redus activitatea NADPH-diaphorazei, un indicator standard al funcției NOS, cu 35 până la 40%. Silențierea genetică a dus la o reducere de 45 până la 50%. Nivelurile de nitrit, un substitut stabil pentru producția de oxid nitric, au scăzut cu 65 până la 70% cu BA-101 și cu 55 până la 60% cu siRNA. Formarea de coloni, cea mai directă măsură a capacității proliferative, a scăzut semnificativ după tratamentul cu BA-101 (p < 0.001) și silențierea nNOS (p < 0.01). Celulele își pierdeau abilitatea de a se multiplica.
Ce a urmat în aval a fost sistematic. Nitrarea tirozinică a proteinelor, măsurată prin imunoreactivitatea 3-nitrotirozinei, a scăzut dramatic după tratamentul cu BA-101 (p < 0.01) și silențierea nNOS (p < 0.001). Semnătura chimică a stresului nitrosativ dispărea.
Apoi, domino-urile. Fosforilarea AKT a scăzut (p < 0.01 cu BA-101; p < 0.05 cu siRNA), în timp ce AKT total a rămas neschimbat. Fosforilarea mTOR în sine a scăzut în ambele condiții (p < 0.01 fiecare). Substratul downstream mTORC1, proteina ribozomală S6, a fost afectat (p < 0.05 cu BA-101; p < 0.01 cu siRNA). Cel mai semnificativ detaliu a fost că TSC2, un regulator negativ principal al semnalizării mTOR, a crescut semnificativ sub ambele tratamente (p < 0.05). Eliminarea semnalului de oxid nitric a permis sistemului de frânare al celulei să revină în funcțiune, asemenea eliberării unei pedale de accelerație care fusese blocată.
Sinaptofitina, un marker tumoral neuroendocrin folosit pentru a evalua identitatea malignă a celulelor de neuroblastom, a scăzut semnificativ cu BA-101 (p < 0.01) și scăderea nNOS (p < 0.05). Celulele tumorale nu doar că își încetineau creșterea, dar deveneau, la nivel molecular, mai puțin recunoscute ca fiind canceroase.
O bună știință pune întrebarea invers. Dacă blocarea oxidului nitric suprimă semnalizarea mTOR, atunci inundarea celulelor cu oxid nitric ar trebui să amplifice această semnalizare. Cercetătorii au expus celulele SH-SY5Y la SNAP, un donator de oxid nitric, la o concentrație de 200 μM timp de 24 de ore.
Fiecare măsură a arătat efectul invers. 3-nitrotirozina a crescut (p < 0.05). TSC2 a scăzut (p < 0.01). Fosforilarea AKT, mTOR și RPS6 a crescut (p < 0.05 pentru fiecare). Experimentul invers a generat un rezultat invers, care este genul de simetrie ce separă o descoperire de o întâmplare.
Cultura celulară poate oferi multe informații, dar nu poate prezice dacă o tumoră dintr-un organism viu va răspunde la fel. Echipa a stabilit neuroblastom xenograft prin injectarea celulelor SH-SY5Y subcutanat în flancurile șoarecilor NOD-SCID de șase săptămâni, a așteptat formarea tumorilor palpabile, apoi a administrat BA-101 intraperitoneal la o doză de 80 mg/kg/zi timp de 22 de zile. Animalele de control au primit doar vehicul.
Tumorile de control au crescut până la aproximativ 1.5 cm în dimensiune maximă. Tumorile tratate nu au crescut. Volumul și greutatea finală a tumorii au fost dramatic reduse în grupul BA-101 (p < 0.001 pentru ambele). Greutatea corporală nu a diferit semnificativ între grupuri, sugerând că compusul a fost tolerat fără toxicitate sistemică evidentă. Datele in vivo au confirmat că mecanismul observat în laborator funcționează într-un organism întreg.
„Magnitudinea suprimării in vivo ne-a atras atenția”, a spus Prof. Haitham Amal, autorul corespunzător al studiului. „Am demonstrat anterior rolul oxidului nitric în glioblastom, dar consistența rezultatelor neuroblastomului în fiecare test, de la fosforilarea proteinelor până la formarea de coloni și creșterea xenograftului, indică faptul că nNOS este mai mult decât un contributor. Se pare că este un motor central al semnalizării care susține această tumoră.”
„Ceea ce m-a convins a fost concordanța între abordările farmacologice și cele genetice”, a spus Dr. Shashank Kumar Ojha. „Când BA-101 și siRNA produc independent aceeași tipologie de efecte în
