Impactul extractului de fum de țigară asupra celulelor căilor respiratorii prin intermediul nanoplasticilor
Un model de laborator a relevat modul în care barierele epiteliale afectate de fum pot lăsa celulele căilor respiratorii mai vulnerabile la un al doilea stresor de mediu.
Un studiu recent publicat online ca un „Articol în Presă” în revista Scientific Reports a investigat în vitro cum influențează extractul de fum de țigară (CSE), o preparare de laborator ce conține substanțe derivate din fum, răspunsurile epiteliale ale căilor respiratorii la nanoparticulele de polistiren (PS-NPs) și dacă expunerea secvențială la acești agenți promovează caracteristici asociate cu boala pulmonară obstructivă cronică (BPOC).
La nivel global, oamenii sunt expuși la fumul de țigară și la poluanții atmosferici care pot dăuna plămânilor. Deși fumatul este principala cauză a BPOC, au apărut îngrijorări legate de particulele de microplastice și nanoplastice, care sunt omniprezente în mediu și au fost detectate în țesuturile umane. Studiile anterioare pe celule și animale sugerează că PS-NPs pot ajunge în plămâni prin inhalare și pot contribui la inflamație, stres oxidativ și leziuni celulare.
Deoarece microplasticile și nanoplasticile au fost detectate și în fumul de țigară, este necesar să înțelegem modul în care fumul de țigară și particulele plastice pot interacționa. Dovezile directe care leagă microplasticile și nanoplasticile de bolile pulmonare umane sunt încă insuficiente, iar cercetările suplimentare sunt necesare pentru a clarifica modul în care expunerile de mediu pot contribui la bolile pulmonare cronice.
În cadrul studiului, cercetătorii au investigat efectele combinate ale CSE și PS-NPs în două linii celulare epiteliale bronșice umane: celulele BEAS-2B imortalizate și celulele 16HBE. CSE a fost preparat prin trecerea fumului principal de la 10 țigări standardizate 1R6F printr-un mediu de cultură celulară, obținându-se un amestec lichid de constituienți derivați din fum, mai degrabă decât o substanță chimică izolată.
Celulele au fost expuse mai întâi la diverse diluții de CSE și ulterior tratate cu PS-NPs pentru a determina dacă amestecul derivat din fum a modificat răspunsurile celulare la expunerea la nanoparticulele plastice. Au fost utilizate testele MTT pentru a evalua activitatea metabolică ca o măsură indirectă a viabilității celulare, precum și testul LDH pentru a analiza daunele membranare și citotoxicitatea.
Au fost folosite PS-NPs marcate fluorescent pentru a măsura asocierea celulară cu nanoparticulele prin microscopia de imunofluorescență în ambele linii celulare și prin citometrie de flux în celulele BEAS-2B. În plus, a fost realizată o analiză a izotopilor stabili în celulele BEAS-2B pentru a estima fracția de carbon derivat din plastic asociat cu probele celulare.
Pentru a determina dacă CSE a afectat funcția barierei epiteliale, cercetătorii au măsurat rezistența electrică transepithelială (TEER), permeabilitatea la Texas Red-dextran și expresia proteinelor de joncțiune epitelială, inclusiv E-cadherin și zonula occludens-1 (ZO-1), folosind PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) și imunofluorescență.
O serie separată de experimente a utilizat celule 16HBE diferențiate, cultivate la o interfață aer-lichid (ALI), oferind un model diferențiat, dar simplificat, care se aseamănă mai mult cu căile respiratorii umane. Aceste culturi celulare au fost testate pentru integritatea epitelială, rezistența barierei, numărul celulelor goblet PAS-pozitive, expresia proteinei ZO-1 și secreția CXCL8.
Analiza statistică a inclus analiza de variație unidirecțională (ANOVA), ANOVA bidirecțională cu măsurători repetate și teste de comparații multiple Tukey, cu semnificație statistică descrisă ca p < 0,05.
Rezultatele studiului au arătat că tratamentul cu CSE și PS-NPs a redus independent activitatea metabolică a celulelor epiteliale bronșice BEAS-2B și 16HBE la concentrații specifice. Expunerea secvențială la CSE și PS-NPs a condus la o scădere semnificativ mai mare a activității metabolice decât fiecare tratament separat, ceea ce sugerează o toxicitate posibilă aditivă.
Analizele LDH au oferit dovezi mai limitate ale creșterii leziunilor celulare în urma expunerii secvențiale. În celulele BEAS-2B, tratamentul cu 10% CSE urmat de 1 µg/mL PS-NPs a crescut semnificativ eliberarea LDH comparativ cu fiecare expunere separată, în timp ce creșterea eliberării LDH a avut loc în anumite combinații de concentrații în ambele linii celulare. Totuși, nu s-a observat nicio creștere în celulele 16HBE expuse la CSE tratate cu doza principală de 1 µg/mL PS-NP.
Cercetătorii au explorat dacă CSE a afectat interacțiunile dintre celulele epiteliale ale căilor respiratorii și PS-NPs. Analiza de imunofluorescență în ambele linii celulare și citometria de flux în celulele BEAS-2B au arătat că pretratarea cu CSE a crescut proporția de celule pozitive pentru PS-NP. Mai precis, expunerea celulelor BEAS-2B la 5% și 10% CSE a crescut proporția de celule pozitive pentru PS-NP, iar 10% CSE a crescut, de asemenea, intensitatea medie a fluorescenței, indicând niveluri mai mari de nanoparticule asociate cu celulele.
Imunofluorescența a arătat o creștere comparabilă a celulelor 16HBE pozitive pentru PS-NP după expunerea la 5% CSE. Măsurătorile expresiei citokeratinei-8 și ale ariei celulare nu au arătat diferențe semnificative, sugerând că semnalul crescut de nanoparticule nu era atribuibil schimbărilor în aceste măsuri.
Pentru a investiga o posibilă explicație pentru motivul pentru care CSE a crescut susceptibilitatea celulară la PS-NPs, cercetătorii au evaluat funcția barierei epiteliale. CSE a crescut semnificativ absorbția Texas Red-dextran intracelular, indicând o permeabilitate mai mare a membranei.
În culturile Transwell, CSE a redus TEER după șase până la opt zile și a crescut permeabilitatea epitelială într-o manieră dependentă de doză după opt zile. Aceste modificări funcționale au fost asociate cu modificări ale nivelurilor de E-cadherin, o proteină de joncțiune epitelială măsurată la nivel de acid ribonucleic mesager (mRNA) și proteine.
Deși expresia mRNA a ZO-1 a rămas neschimbată, expresia proteică a ZO-1 a scăzut după tratamentul cu 10% CSE, susținând dovezile de integritate joncțională afectată și funcția barierei epiteliale compromise. Studiile utilizând celule 16HBE diferențiate cultivate în condiții ALI au susținut și extins aceste constatări legate de barieră într-un model care se aseamănă mai mult cu căile respiratorii umane.
