Neuroplex: Monitorizarea simultană a nouă populații neuronale la șoareci în mișcare
O echipă de cercetători de la Max Planck Florida Institute for Neuroscience (MPFI), în colaborare cu ZEISS și MetaCell, a dezvoltat un nou sistem de imagistică numit Neuroplex.
Această tehnică, publicată în eLife, permite monitorizarea simultană a activității a până la nouă populații neuronale distincte în șoareci care se mișcă liber, accelerând semnificativ explorarea științifică a modului în care creierul controlează comportamentul.
Neuroștiințele s-au confruntat mulți ani cu o limitare fundamentală: miniscopurile, microscoapele mici montate pe cap folosite pentru a observa activitatea neurală în animalele care se comportă, puteau capta activitatea neuronală, dar nu puteau distinge în mod fiabil mai mult de două tipuri diferite de celule cerebrale simultan.
„Pentru a înțelege creierul, trebuie să corelăm modelele de activitate din neuronii specifici cu comportamentul. Putem folosi etichete pentru a colora diferite populații de neuroni, dar atunci când folosim miniscopuri pentru a corela activitatea neurală cu comportamentul, nu am putut distinge mai mult de două populații. Acest lucru a îngreunat comparația activității între tipuri de celule și circuite pentru a înțelege cum reglează circuitele comportamentul”, a declarat Mary Phillips, autor principal.
Pentru a depăși această limitare, cercetătorii erau nevoiți să testeze un tip de celulă la un moment dat, repetând aceleași experimente comportamentale, dar etichetând tipuri distincte de neuroni de fiecare dată. Acest proces iterativ era lent și costisitor, împiedicând, de asemenea, comparațiile directe între diferite tipuri de neuroni în același animal, complicând concluziile din cauza diferențelor între animalele individuale.
Ca alternativă, cercetătorii au delimitat diferitele tipuri de neuroni după experimentul comportamental, prin îndepărtarea și felierea țesutului cerebral, colorând diferite tipuri de neuroni, apoi imaginând țesutul cerebral procesat folosind microscoape care pot distinge multiple culori. Cu toate acestea, asocierea celulelor imaginilor cu un miniscope în animalul viu cu cele din țesutul cerebral procesat post-mortem a fost provocatoare și cu un randament redus, rezultând o pierdere semnificativă de date. În plus, această abordare a distrus capacitatea de a urmări activitatea tipurilor de celule identificate de-a lungul timpului pentru a determina cum se schimbă activitatea acestora cu învățarea, îmbătrânirea sau pe parcursul progresiei bolii.
Neuroplex este soluția dezvoltată de echipa MPFI, împreună cu colaboratorii de la ZEISS și MetaCell. Această tehnică combină două abordări de imagistică complementare în același animal viu. Cercetătorii etichetează până la nouă circuite neuronale diferite sau tipuri de celule folosind o gamă de marcaje fluorescente de diferite culori. Apoi, folosesc un miniobiectiv și un miniscope montat pe cap pentru a înregistra activitatea neuronală a întregii populații etichetate în șoareci care se mișcă liber.
După imaginarea cu miniscope-ul, care nu poate distinge între marcajele fluorescente, miniscope-ul este îndepărtat cu grijă, iar șoarecele este poziționat sub un microscop confocal capabil să distingă multe culori diferite.
Cercetătorii au utilizat ZEISS LSM 980, un microscop confocal cu capacități de detecție spectrală pentru a distinge fiecare dintre diferitele etichete de culoare. Cu microscopul confocal, aceiași neuroni vizualizați cu miniscope sunt imaginați prin aceeași lentilă, dar de această dată etichetele colorate sunt vizualizate, identificând care neuroni aparțin fiecărui tip specific. În final, imaginile de la miniscope și cele de la microscopul confocal sunt co-înregistrate folosind repere anatomice și un instrument de aliniere personalizat, dezvoltat de cercetători împreună cu MetaCell. Rezultatul este că echipa poate mapa identitatea de culoare a fiecărui neuron direct pe înregistrarea activității sale funcționale.
„Ca parte a contribuției MetaCell la acest proiect, am ajutat la transformarea datelor complexe colectate într-un flux de lucru computațional practic care permite imagistica, înregistrarea și analiza cu o mai mare precizie, reproducibilitate și încredere. Neuroplex arată cum instrumentele computaționale bine concepute pot ajuta cercetătorii să înțeleagă datele complexe de imagistică biologică și să studieze multiple populații neuronale simultan și de-a lungul timpului”, a spus Zhe Dong, co-autor și Data Scientist la MetaCell.
Ca dovadă de principiu, cercetătorii au vizat retrograd nouă regiuni cerebrale care primesc proiecții din cortexul prefrontal medial, o zonă a creierului importantă pentru luarea deciziilor. Aceasta le-a permis să folosească un marker fluorescent distinct pentru a distinge neuronii care proiectează din cortexul prefrontal către alte nouă regiuni cerebrale. Au înregistrat activitatea neuronilor din toate cele nouă circuite simultan, în timp ce animalele interacționau social, mirosind, apropiindu-se și urmându-se.
„Neuroplex a permis comparații directe ale modelelor de activitate neuronală între circuitele celulare în timpul comportamentului social, depășind provocările de lungă durată în înregistrările cu miniscope și extinzând dramatic eficiența și reproducibilitatea colectării datelor”, a explicat Ryohei Yasuda, autor senior.
Cercetătorii au descoperit că aproximativ 75% dintre neuronii activi puteau fi atribuiți uneia dintre cele nouă tipuri specifice de celule, iar programul automatizat creat pentru a atribui un neuron unui grup specific a funcționat cu o precizie de 90% și cu puține rezultate fals pozitive.
„Datorită faptului că Neuroplex se desfășoară complet în animalul viu prin aceeași lentilă implantată, permite oamenilor de știință să măsoare modul în care diferite populații de neuroni își schimbă activitatea de-a lungul timpului. Cercetătorii pot identifica populațiile celulare înainte de comportament și pot monitoriza aceiași neuroni pe parcursul săptămânilor sau lunilor, permițând studii asupra învățării, îmbătrânirii și progresiei bolii de-a lungul timpului”, a explicat Phillips.
Echipa lucrează deja la îmbunătățiri suplimentare ale tehnicii pentru a crește precizia identificării codului de culoare. De asemenea, speră să facă Neuroplex accesibil tuturor laboratoarelor, inclusiv celor care nu dispun de sisteme confocale spectrale de înaltă calitate. Scopul lor este de a disemina această abordare pe scară largă în comunitatea neuroștiințifică prin utilizarea microscopelor cu filtre standard bazate pe câmp larg, aducând beneficiile fundamentale ale metodei întregii comunități de cercetare.
„Creșterea eficienței colectării datelor pentru datele funcționale specifice tipului de celule sau circuitului va accelera înțelegerea noastră a calculilor neuronale care stau la baza comportamentului”, a spus Phillips. „Dincolo de cercetarea de bază, ne așteptăm ca această abordare să accelereze înțelegerea schimbărilor funcționale specifice circuitului în modelele de boală, în special în modelele de boli neurodezvoltare sau neurodegenerative, care beneficiază de studii longitudinale ce examinează progresia bolii.”
Echipa a dezvoltat, de asemenea, tutoriale pentru oamenii
