O nouă platformă de microscopie permite imagistica cerebrală profundă fără daune tisulare
Pe măsură ce lumina pătrunde mai adânc în creier, aceasta se dispersează.
Microscopia cu trei fotoni, considerată cea mai avansată metodă în prezent, reduce fluorescența de fond rezultată și, în principiu, poate imagistica mult mai adânc decât tehnicile anterioare, însă pentru a realiza acest lucru, utilizează limitele medii de putere ale laserului care pot provoca supraîncălzire și daune țesuturilor vii.
În loc să accepte acest compromis, o echipă de la Rockefeller a redesenat întregul sistem de imagistică de la zero. Într-un articol publicat în Nature Methods, echipa descrie o platformă de microscopie inovatoare numită Three-photon Ultra-Deep Imaging (TrUDI), care împinge microscopie cu trei fotoni aproape de limitele sale teoretice, parțial prin reproiectarea ratei și energiei impulsurilor laser, modul în care acestea sunt livrate și scanate la probă, toate în limitele sigure de expunere la puterea laserului. Rezultatul este o creștere de aproximativ 250 de ori a eficienței imagistice, permițând cercetătorilor să imagineze întregul cortex al șoarecelui și să înregistreze activitatea neuronală în regiuni adânci ale creierului, precum întreaga gamă de adâncimi a hipocampului și striatului, fără a elimina chirurgical țesutul de deasupra.
„Adesea, în tehnologie, oamenii se bazează pe un anumit laser sau parametru din motive istorice, iar toată lumea acceptă acele limitări”, spune Alipasha Vaziri. „Am vrut să adoptăm o abordare de la zero. Prin a nu lua nimic ca fiind garantat și întrebându-ne cum ar arăta un sistem optimizat complet pentru maximizarea adâncimii de imagistică cu trei fotoni, am descoperit că ceea ce se considera anterior factori limitativi ar putea fi depășite.”
Una dintre cele mai mari provocări ale neuroștiinței este înțelegerea modului în care grupuri disparate de neuroni adânc în creier colaborează pentru a produce comportament. Deși microscopurile moderne pot înregistra activitatea neuronilor individuali aproape de suprafața creierului în animale vii, imagistica unor zone largi de neuroni adânc în creier a rămas dificilă, deoarece țesutul cerebral dispersează lumina. Pe măsură ce lumina pătrunde mai adânc, devine imposibil de distins neuronii de fluorescența de fond.
De ani de zile, cercetătorii au încercat să depășească această limită utilizând forme din ce în ce mai sofisticate de microscopie fluorescentă, în care moleculele ingineriate emit lumină atunci când sunt illuminate de un laser. Microscopia cu trei fotoni, printre cele mai mari realizări în acest domeniu, poate teoretic imagistica mult mai adânc decât alte metode, inclusiv microscopie cu două fotoni, mai utilizată, deoarece generează mai puțină fluorescență de fond. Însă atingerea acelor adâncimi cu microscopie cu trei fotoni se confruntă cu limite practice.
„Acea cerință mai mare pentru energia impulsurilor în excitația cu trei fotoni stabilește în cele din urmă o limitare asupra cantității de putere laser pe care o poți introduce în creier la ratele de repetiție a laserului utilizate de obicei înainte de a-l deteriora”, explică Vaziri. „Ești limitat de căldură, iar în același timp, numărul de fotoni care ajung la țintă scade exponențial din cauza dispersiei, făcând ca semnalul de fluorescență să devină indistinctibil de fundal.”
Microscopia cu trei fotoni a fost proiectată pentru a extinde adâncimea de aproximativ 0,8 mm a microscopiei cu două fotoni, dar a rămas în urma potențialului său. „În orice schemă de excitație cu mai mulți fotoni, există o limită de adâncime la care fundalul și semnalul devin egale. Pentru excitația cu trei fotoni în creierul de șoarece, teoretic acea limită de adâncime ar trebui să fie de aproximativ 2,3 milimetri”, spune Vaziri. „Dar adâncimea maximă la care s-a realizat înregistrarea funcțională anterior a fost de aproximativ 1,2 milimetri.”
Vaziri a decis să reproiecteze sistemul de imagistică de la zero. Echipa sa a început prin utilizarea modelor computerizate pentru a determina limitele teoretice ale imagisticii adânci în creier și pentru a identifica modul în care un microscop ar trebui să fie proiectat pentru a se apropia de acestea. Ghidați de aceste calcule, s-au întors la tablă și au optimizat fiecare aspect al microscopiei cu trei fotoni, în special prin livrarea unor impulsuri laser mai puține, dar mult mai energice, păstrând aceeași putere medie a laserului și prin reproiectarea modului în care microscopul focalizează și colectează lumina. Au dezvoltat chiar un sistem de excitație care identifică neuronii și activează laserul doar atunci când aceștia sunt traversați, reducând expunerea la laser cu până la 80% în timpul sesiunilor lungi.
„Modul în care am realizat acest lucru a fost printr-o serie de optimizări foarte sistematice, principiale și de la zero”, afirmă Vaziri. „Am încercat să nu facem presupuneri ad hoc despre alegerile parametrilor microscopului sau ale laserului, avându-le toate informate de scopul final pe care îl servesc, care este maximizarea adâncimii de accesibilitate în timp ce se rezolvă fidel activitatea trecătoare a neuronilor individuali în limitele sigure de expunere la laser.”
Împreună, aceste optimizări s-au acumulat. Produsul final, platforma TrUDI, se laudă cu o creștere de aproximativ 250 de ori a eficienței generării fluorescenței fără a se baza pe puterea laserului crescută care ar putea încălzi și deteriora țesutul cerebral. „Când privești parametrii individuali, o ajustare optică ar putea oferi doar o îmbunătățire de patru sau cinci ori, ceea ce este ușor de trecut cu vederea atunci când te confrunți cu o problemă exponențială dificilă”, spune el. „Dar dacă ai suficiente dintre aceste optimizări și fiecare dintre aceste îmbunătățiri este multiplicativă, atunci ai brusc ceva care este de 200 de ori mai bun.”
Utilizând TrUDI, echipa a validat apoi noul sistem în șoareci, imaginând activitatea populațiilor neuronale pe diferite adâncimi corticale în structuri adânci ale hipocampului și striatului, atingând adâncimi ale țesutului de până la 2,1 milimetri în creierul mamiferelor intact, mult peste limitele anterioare, care se blocaseră în jurul valorii de 1,2 milimetri. Pentru prima dată, echipa a surprins activitatea în mai multe regiuni interconectate ale hipocampului și adânc în striat, fără a elimina chirurgical cortexul de deasupra.
Analizele țesutului cerebral concepute pentru a detecta leziuni legate de căldură și alte semne de daune nu au găsit dovezi de inflamație, pierdere neuronală sau daune ADN sub condițiile de imagistică utilizate în studiu, confirmând că TrUDI poate atinge în siguranță adâncimi considerate anterior impracticabile pentru imagistica optică.
Astfel, TrUDI oferă o fereastră în circuitele cerebrale care, până acum, au fost în mare parte inaccesibile. „Există regiuni ale striatului care sunt inaccesibile, iar există încă o serie de nuclee cerebrale adânci care necesită în continu
