O nouă metodă de screening genetic oferă perspective asupra dezvoltării umane
O nouă metodă de screening genetic permite cercetătorilor să modifice eficient genele individuale în întregi țesuturi, oferind noi perspective asupra dezvoltării umane.
Cercetarea, publicată anterior ca preprint revizuit în eLife și apărută astăzi în versiunea finală, este descrisă de editorii eLife ca un studiu de referință. Aceștia afirmă în evaluarea lucrării că „această realizare tehnică este excepțională și unul dintre primele studii care dezvăluie cunoștințe noi despre dezvoltarea umană prin modele de embrioni”.
Realizarea screening-ului genetic la oameni și alte animale ridică provocări etice și practice. O alternativă este utilizarea organoidelor – mini-organe tridimensionale – dezvoltate din celule stem pluripotente umane (hPSCs). Aceste celule au potențialul de a se dezvolta în orice tip de țesut. Cu toate acestea, încercările de a elimina sau a diminua genele individuale în aceste modele conduc, de obicei, la un efect de mozaic, ceea ce face imposibilă studierea dezvoltării structurale la nivelul întregului țesut (sau morfogeneza).
„Capacitatea de a efectua perturbări ale genei unice în modele robuste in vitro ale dezvoltării umane este esențială pentru a descompune mecanismele care conduc morfogeneza embrionară umană”, spune co-autorul principal Roya Huang. La momentul studiului, aceasta se afla în laboratorul autorului principal Sharad Ramanathan, în cadrul Departamentului de Biologie Moleculară și Celulară, Universitatea Harvard, și este acum cercetător postdoctoral în Departamentul de Biologie Moleculară și Celulară, Universitatea din California, Berkeley. „Până acum, acest obiectiv a fost limitat de variabilitatea în morfogeneza organoidului și de lipsa metodelor scalabile pentru perturbări uniforme ale genei unice. Am dezvoltat o metodă de a genera și aplica concentrații mari de virus direct asupra celulelor stem în volume mici, rezultând o abordare simplificată de editare a genelor care poate diminua uniform genele în întregul organoid.”
Metodele existente de editare a genelor CRISPR pentru screening-ul genelor în țesuturi întregi sunt limitate de timpul și costurile de izolare și cultivare a clonelor editate individual, în timp ce abordările non-clonale alternative care folosesc viruși pentru a introduce gene în celule depind de pași laborioși și consumatori de timp pentru concentrarea virusului.
„De obicei, editarea genelor CRISPR necesită modificarea unei bucăți circulare de ADN – un plasmid – pentru a conține un anumit material genetic, un proces care necesită de obicei mai multe etape secvențiale”, explică co-autorul principal Giridhar Anand. Acesta se afla, de asemenea, în laboratorul lui Ramanathan în timpul studiului și este acum cercetător postdoctoral la Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York. „Noi, în schimb, am realizat mai mulți pași în paralel și am efectuat un pas stringent de purificare a ADN-ului la început pentru a ne asigura că o proporție mare din plasmidele rezultate erau concepute corect. Aceasta ne-a permis să sărim peste etapa următoare în pregătirea plasmidelor, și anume procesul consumator de timp de selectare și cultivare a clonelor specifice.” Plasmidele rezultate au fost apoi ambalate pentru a fi livrate celulelor organoid prin intermediul unui virus.
Următoarea provocare pentru echipă a fost generarea unor concentrații mari de virus. Aceștia au optimizat creșterea virusului în linii celulare, descoperind că reducerea volumului mediului în care cresc celulele a crescut randamentul virusului. De asemenea, au constatat că adăugarea virusului în același timp cu semănarea celulelor stem pe plăcuța de creștere a îmbunătățit absorbția virusului comparativ cu metoda standard de a semăna celulele mai întâi și apoi de a adăuga virusul. Această metodă optimizată a dus la absorbția virusului de aproape toate hPSCs.
Pentru a realiza diminuarea mai multor gene într-un singur experiment, echipa a dezvoltat o modalitate de a livra plasmide diferite, fiecare purtând o bucată diferită de ADN, către coloniile separate de celule pe un diapozitiv de microscop. Aceste celule au fost apoi diferențiate în diferite tipuri de organoide, fiecare având o modificare unică a genei în fiecare celulă.
Pentru a testa abordarea lor, echipa a ales 20 de gene considerate implicate într-un pas crucial în dezvoltarea creierului, în care o placă neurală plană se închide într-un tub neural. Dacă acest pas nu se realizează în timpul dezvoltării, provoacă un defect de naștere fatal numit anencefalie, unde un bebeluș se naște fără o parte frontală a creierului (cortex) corect pliată și fără partea de gândire și coordonare a creierului (cerebel).
Echipa a folosit metoda lor simplificată CRISPR pentru a produce plasmide pentru aceste 20 de gene, plus alte 57 de gene care sunt mai puțin legate de dezvoltarea neurală. Au introdus aceste plasmide în hPSCs și apoi au diferențiat celulele în organoide ale tubului neural.
După incubare, au colorat organoidele pentru markeri tisulari neuronali și au studiat forma lor la microscop. Au descoperit că diminuarea a trei gene numite ZIC2, SOX11 și ZNF521 a arătat defecte majore de închidere a tubului neural. În organoidele cu diminuarea ZIC2 și SOX11, plăcile neuronale erau complet deschise, în timp ce în organoidele cu diminuarea ZNF521 existau multiple puncte de închidere.
Echipa a studiat apoi datele de exprimare ale genei unice pentru a vedea dacă existau alte gene afectate de diminuarea acestor trei jucători principali. Au identificat un subset suplimentar de gene care erau mai puțin active în organoidele cu diminuarea ZIC2 și SOX11 și mai active în organoidele cu diminuarea ZNF521. Când au încercat să diminueze aceste gene individual, nicio genă unică nu a dus la același defect de închidere a tubului neural. Aceasta sugerează că ZIC2, SOX11 și ZNF521 controlează în mod normal o combinație de gene subordonate pentru a dirija închiderea tubului neural.
„Platforma pe care o raportăm aici este scalabilă, reduce semnificativ timpul și costurile comparativ cu abordările de diminuare clonală și poate fi realizată într-un mediu de laborator academic, permițând perturbări ale genei unice la nivelul țesutului la o scară care nu a fost posibilă anterior, fie în organoide cultivate în laborator, fie în modele de mamifere”, afirmă autorul principal Sharad Ramanathan. „Abordarea noastră umple o lacună critică între studiul genetic al organismelor model tradiționale și biologia dezvoltării umane, oferind o cale pentru noi perspective mecaniste și descoperirea de ținte terapeutice pentru defectele tubului neural și alte malformații congenitale.”
