O nouă metodă de secvențiere ARN îmbătățește diagnosticarea bolilor rare
Cercetătorii de la Spitalul pentru Copii din Philadelphia (CHOP) au dezvoltat o nouă strategie de secvențiere ARN care poate revela modul în care variantele genetice perturbă funcția genelor și îmbunătățește diagnosticul bolilor rare.
Un studiu publicat astăzi în revista Science Advances demonstrează că această platformă poate identifica variante genetice cauzatoare de boli și poate oferi diagnostice moleculare pentru pacienți anterior nediagnosticați, inclusiv pentru cinci indivizi ale căror condiții au rămas nerezolvate după testele standard.
Secvențierea exomului și a genomului sunt metode larg utilizate pentru identificarea variantelor genetice responsabile de bolile rare. Totuși, aceste abordări au un randament diagnostic de doar 20% până la 50%, ceea ce înseamnă că mai mult de jumătate dintre pacienții cu boli rare suspectate nu reușesc să obțină un diagnostic molecular. Multe variante genetice provoacă boli prin perturbarea modului în care moleculele ARN sunt transcrise și procesate, ceea ce face ca efectele acestora să nu fie întotdeauna înțelese doar din secvența ADN-ului. Prin urmare, cercetătorii și clinicienii se îndreaptă din ce în ce mai mult spre secvențierea ARN pentru a interpreta mai bine modul în care variantele genetice alterează activitatea și funcția genelor, provocând boli.
ARN-ul este o modalitate puternică de diagnosticare a bolilor rare. Prin observarea directă a moleculelor ARN, putem obține o imagine mai completă despre cum variantele genetice modifică produsele genice, în moduri care nu pot fi revelate doar prin secvențierea ADN-ului.
Metodele tradiționale de secvențiere ARN fragmentează moleculele ARN înainte de secvențiere, ceea ce face dificilă reconstrucția moleculelor ARN complete și corelarea variantelor asociate bolii cu evenimentele anormale de procesare ARN din cadrul aceleași molecule. În contrast, secvențierea ARN de lungă citire poate secvenția direct molecule ARN complete, de la un capăt la altul, oferind potențialul de a transforma interpretarea variantelor genetice ghidată de ARN. Totuși, mai multe provocări, inclusiv acuratețea, costul și scalabilitatea, au limitat utilizarea pe scară largă a secvențierii ARN de lungă citire pentru bolile rare până în prezent.
Pentru a aborda aceste obstacole, cercetătorii de la CHOP au dezvoltat STRIPE (Sequencing Targeted RNAs Identifies Pathogenic Events), o strategie de secvențiere ARN de lungă citire care permite secvențierea profundă a moleculelor ARN complete pentru orice panou de gene personalizat specific bolii.
STRIPE se bazează pe lucrările anterioare de la CHOP, care au dezvoltat TEQUILA-seq, o tehnologie scalabilă și cu cost redus pentru secvențierea moleculelor ARN complete.
„TEQUILA-seq a fost conceput pentru a face secvențierea ARN de lungă citire țintită cost-eficientă și scalabilă”, a spus coautorul Lan Lin. „Cu un cost de aproximativ 100 de dolari pe probă pentru ARN, STRIPE permite secvențierea ultra-adâncă a genelor relevante pentru boli la o scară practică pentru aplicațiile clinice.”
Pentru a evalua STRIPE, cercetătorii au aplicat platforma la două grupuri de boli rare studiate extensiv la CHOP – tulburările congenitale de glicozilare (CDG) și bolile mitocondriale primare (PMD). Aceste clase de boli includ multe condiții genetice diverse, cu noi variante cauzatoare de boli continuând să fie descoperite, făcându-le potrivite pentru evaluarea eficacității STRIPE.
„O provocare majoră în diagnosticul bolilor rare ghidat de ARN este că țesuturile relevante pentru boli sunt adesea greu de obținut de la pacienți”, a spus coautorul Rebecca Ganetzky. „STRIPE permite analiza de înaltă calitate a ARN-ului din țesuturi clinice accesibile, cum ar fi fibroblastele cutanate și sângele, capturând în același timp semnalele relevante pentru boală necesare pentru a interpreta efectele variantelor genetice la nivel de ARN.”
„Aceasta a fost o colaborare reciproc avantajoasă în care noile diagnostice CDG ale STRIPE au putut fi validate datorită disfuncției măsurabile pe care o prezintă acești pacienți în glicozilare, demonstrând astfel tehnologia lor”, a spus coautorul Andrew C. Edmondson. „La rândul său, pacienții CDG cu nevoi diagnostice mari au putut avea acces la o tehnologie nouă după ce testările standard de îngrijire au eșuat și, în cele din urmă, să primească un diagnostic molecular, punând capăt odiseei lor diagnostice și facilitând accesul lor la îngrijirea clinică adecvată.”
Cercetătorii au aplicat STRIPE la 88 de indivizi din cele două grupuri de boli și la controale sănătoase. Platforma a reidentificat cu acuratețe variantele cauzatoare de boli cunoscute și a revelat consecințele adesea complexe și uneori neprevăzute ale acestor variante la nivel de ARN. Importanța STRIPE a clarificat rolul variantelor anterior identificate cu semnificație incertă și a descoperit noi variante cauzatoare de boli la cinci pacienți anterior nediagnosticați, permițând clinicienilor să stabilească diagnostice moleculare care fuseseră elusive.
De la dezvoltarea sa, STRIPE a fost utilizat pentru a analiza peste 500 de pacienți în multiple programe clinice la CHOP, demonstrând potențialul său în lumea reală și scalabilitatea pentru diagnosticul bolilor rare.
„Prin revelarea directă a modului în care variantele genetice perturbă moleculele ARN, STRIPE oferă o punte de legătură între diagnosticul genetic și mecanismele bolii, precum și terapiile țintite”, a afirmat Xing. „Mai general, această lucrare reflectă un efort de lungă durată de a interpreta variantele genetice la nivelul moleculelor ARN complete, iar noi credem că STRIPE poate servi ca bază pentru medicina de precizie bazată pe ARN în bolile rare, corelând diagnosticele de precizie cu terapiile de precizie.”
