Importanța UV-Vis în asigurarea calității în industria biopharma
În cadrul acestui interviu, expertul în industrie Brian Matlock explică modul în care măsurătorile UV-Vis și fluorescență ajută la evaluarea concentrației de acizi nucleici și proteine. De asemenea, el discută despre rolul NanoDrop în sprijinirea unui control mai rapid al calității acestor substanțe.
Brian Matlock, cu o experiență de aproape 20 de ani în utilizarea produselor NanoDrop, rememorează perioada din școala de doctorat și primii ani ai carierei sale, când cuantificarea ADN-ului și ARN-ului se făcea aproape zilnic folosind cuvete și metode UV-Vis tradiționale. Acest flux de lucru era marcat de multe neajunsuri, precum necesitatea de a efectua diluții, de a curăța cuvele de cuarț între probe și de a calcula manual concentrațiile, ceea ce era consumator de timp și putea conduce la variații între utilizatori și măsurători.
NanoDrop a revoluționat acest proces prin posibilitatea de a efectua măsurători de microvolum fără diluție, oferind utilizatorilor citiri directe ale concentrației și folosind o lungime de cale variabilă, permițând astfel gestionarea unei game largi de concentrații ale probelor. Astfel, a simplificat un pas esențial în laboratoarele de biologie moleculară.
Măsurarea UV-Vis se referă, în esență, la evaluarea cantității de lumină absorbită de o probă la anumite lungimi de undă. Pentru molecule precum ADN, ARN și proteine, absorbția este direct legată de concentrație. Un aspect util, mai ales în cazul NanoDrop, este că permite colectarea de date spectrale complete, nu doar obținerea unui singur număr de concentrație. Aceasta înseamnă că se pot identifica și alte componente prezente în probă, cum ar fi contaminanții proteici sau compușii organici care ar putea afecta lucrările ulterioare.
UV-Vis este, de asemenea, o tehnică fără marcaje, ceea ce înseamnă că nu se adaugă nimic la probă. Este foarte rapidă, iar utilizatorii pot obține rezultate în câteva secunde. Această tehnică bine stabilită rămâne extrem de utilizată deoarece oferă atât date de concentrație, cât și o evaluare rapidă a calității probei înainte de a avansa în fluxul de lucru.
Adoptarea extinsă a NanoDrop în biologia moleculară și în procesele din biopharma se aliniază cu boom-ul genomic din anii 2000, când laboratoarele au început să genereze un număr mai mare de probe de ADN și ARN. A apărut astfel o nevoie reală de a cuantifica rapid aceste probe înainte de a trece la aplicații ulterioare.
NanoDrop a facilitat obținerea rapidă a datelor precise de concentrație, necesită foarte puțină probă și oferă informații spectrale complete. În multe situații, utilizatorii aveau la dispoziție un volum mic de probă, iar capacitatea de a măsura doar cu un microvolum a fost un avantaj semnificativ. NanoDrop a ajutat utilizatorii să înțeleagă calitatea probei, pe lângă cuantificare, devenind astfel aplicabil în diverse laboratoare de științe ale vieții.
Pe măsură ce tehnologia a evoluat, NanoDrop a început să depășească raportarea simplă a ratelor de puritate clasice, cum ar fi 260/280 și 260/230. Odată cu lansarea platformei NanoDrop One, a fost introdusă suitele Acclaro, care includ algoritmi mai avansați. Acești algoritmi permit utilizarea mai eficientă a datelor spectrale complete, ajutând astfel la identificarea contaminanților potențiali din probă. Acest aspect este important deoarece contaminanții pot influența măsurătorile de concentrație și pot afecta aplicațiile ulterioare.
Azi, NanoDrop acționează ca un pas central de control al calității în fluxurile de lucru critice, inclusiv qPCR, secvențiere, clonare și expresie proteică. Oferă un punct de control rapid în care oamenii de știință pot confirma atât concentrația, cât și calitatea înainte de a investi timp, reactanți și resurse în procesele mai complexe de downstream.
În fluxurile de lucru care implică acizi nucleici, precum construcția de vectori, prepararea plasmidelor sau fabricarea oligonucleotide pentru kituri de diagnostic, odată ce ADN-ul sau ARN-ul sunt pregătite, oamenii de știință au nevoie de o metodă rapidă pentru a verifica atât concentrația, cât și calitatea înainte de a trece la pași precum ligarea, PCR și secvențiere.
Aici intervine NanoDrop. Cu doar un sau două microlitri de probă, utilizatorii pot obține o măsurare a concentrației împreună cu date spectrale complete. Acest lucru înseamnă că se confirmă nu doar cât material au, ci și dacă există contaminanți care ar putea interfera cu procesele ulterioare. Chiar și cantități mici de contaminare pot afecta eficiența enzimatică și pot duce la rezultate inconsistente. În medii cu un volum mare de probe, cum ar fi producția de oligonucleotide, consistența devine și mai critică.
În ceea ce privește dezvoltarea proteinelor și a anticorpilor, NanoDrop joacă un rol similar. Este utilizat pentru a cuantifica rapid concentrația proteinelor, de obicei folosind A280, în timpul etapelor de purificare sau înainte de teste ulterioare. Obiectivul este de a obține o măsurare rapidă și fiabilă, verificând totodată și orice ar putea interfera cu pașii următori. În fluxurile de lucru proteice, calitatea și concentrația probei sunt esențiale, deoarece acestea pot influența performanța testelor, deciziile de purificare și consistența generală a procesului.
În cazul probelor mai complexe sau foarte concentrate, instrumente precum Acclaro Pro pot ajuta la îmbunătățirea preciziei și consistenței. Acest lucru devine deosebit de important atunci când se scalează un proces sau se iau decizii legate de loturi.
În cadrul fluxurilor din biopharma și bioprocesare, NanoDrop acționează ca un punct de control rapid al calității. Acesta ajută la confirmarea că probele sunt gata înainte de a avansa în procesele mai complexe, costisitoare sau sensibile la timp. În aceste fluxuri, importanța acestui punct de control este deosebit de valoroasă, deoarece deciziile sunt adesea luate între loturi, etape de producție sau fluxuri de dezvoltare. Dacă concentrația este inexactă sau dacă sunt prezenți contaminanți, se pot crea probleme mai târziu în proces.
NanoDrop oferă utilizatorilor o metodă rapidă de verificare a concentrației și calității probelor utilizând volume foarte mici de probă. Aceasta ajută la reducerea întârzierilor inutile și oferă mai multă încredere înainte de a avansa în aplicații precum secvențiere, PCR, expresie proteică, purificare sau teste ulterioare.
NanoDrop Ultra îmbunătățește capacitățile de bază UV prin adăugarea fluorescenței de microvolum, ceea ce aduce un nivel suplimentar de sensibilitate și specificitate platformei. Prin absorbție, se obțin date spectrale complete, iar aceste informații pot fi folosite pentru a identifica ce altceva ar putea fi prezent în probă. Cu toate acestea, absorbția poate fi uneori înșelătoare atunci când contaminanții afectează concentrația măsurată. Aici devine utilă fluorescența.
Fluorescența reprezintă o măsurare mult mai sensibilă decât absorbția și este, de asemenea, extrem de specifică. În testele de fluorescență, un colorant se leagă doar de molecula de interes, cum ar fi ADN, ARN sau proteină, oferind utilizatorilor o măsurare mai specifică a concentrației, mai ales când este necesară o sensibil
