Flux de lucru automatizat pentru pregătirea probelor bacteriene în secvențierea genetică
Inginerii biomedicali de la Universitatea Brown au dezvoltat un flux de lucru complet automatizat care simplifică și accelerează pregătirea probelor bacteriene pentru secvențierea genetică.
Metoda, denumită Pathogen2Read, optimizează un punct critic în procesul de secvențiere genetică și ar putea permite laboratoarelor mici, fără automatizare de înaltă capacitate, să participe mai eficient la rețelele de monitorizare a focarelor operate de Administrația pentru Alimente și Medicamente (FDA) și Centrele pentru Controlul și Prevenirea Bolilor. Aceasta ar putea conduce la răspunsuri mai rapide în cazul bolilor transmise prin alimente și altor focare.
„Secvențierea de generație următoare a devenit un element esențial în detectarea și prevenirea focarelor”, a declarat Kathryn Whitehead, studentă absolventă la Școala de Inginerie a Universității Brown, care a condus acest proiect. „Însă pregătirea probelor implică un proces manual laborios, care poate întârzia răspunsurile în timp real la focare. Laboratorul nostru a dezvoltat ceea ce, după cunoștințele noastre, este prima metodă științifică complet automatizată care ocolește aceste limitări.”
Cercetarea care descrie și testează metoda, dezvoltată în colaborare cu cercetători de la FDA și cu finanțare din partea companiei biotech Revvity, este publicată în BMC Genomics.
Secvențierea de generație următoare a revoluționat epidemiologia modernă, permițând oamenilor de știință să secvențieze rapid genomurile întregi ale patogenilor potențiali în câteva ore sau zile. Aceasta permite cercetătorilor și profesioniștilor din sănătatea publică să identifice rapid patogenii implicați în focarele de boală sau să identifice noi mutații genetice care pot face patogenii cunoscuți mai greu de tratat.
Procesul de pregătire a probelor pentru secvențiere este complex și necesită multă muncă manuală. Este un proces în mai multe etape care implică izolarea microbilor, deschiderea membranelor celulare (un proces numit liza), extragerea și purificarea ADN-ului și aranjarea acestuia în segmente lizibile. Tehnicile actuale necesită între opt și zece ore de muncă manuală, plus până la 16 ore de timp de așteptare. Orice greșeală pe parcurs poate necesita reluarea întregului proces.
Fluxul de lucru Pathogen2Read include etape de pregătire a testelor, software personalizat și un cocktail de enzime special pregătit care permite unei mașini de manipulare a lichidelor desktop să efectueze toate etapele de pregătire a probelor de ADN – liza, extracția și pregătirea bibliotecii – complet singură. Cercetătorii au reușit să comprime timpul de pregătire manuală de la aproape o zi la sub 45 de minute. Odată ce un operator încarcă probele brute și reactivii pe o singură plăcuță, sistemul se ocupă automat de restul pe parcursul unei runde de șase ore, generând biblioteci de ADN pregătite pentru secvențiere.
Calitatea bibliotecilor de ADN este esențială, în special când se caută mutații într-o tulpină bacteriană.
„Deoarece căutăm mutații mici care pot fi implicate în rezistența la medicamente, de exemplu, este ușor să le ratăm dacă nu capturăm toate secvențele”, a spus Anubhav Tripathi. „Astfel, calitatea pregătirii probelor este critică.”
La baza noului flux de lucru, Whitehead afirmă că se află cocktailul de enzime, care deschide rapid și eficient diferite tipuri de bacterii. Bacteriile au două forme structurale principale, gram-negative și gram-pozitive. Structura membranelor bacteriilor gram-pozitive le face mai greu de rupt pentru extragerea ADN-ului. Aceasta poate provoca omisiunea bacteriilor gram-pozitive dintr-o probă dacă procesul de pregătire nu reușește să le deschidă. Cercetătorii au demonstrat un cocktail de enzime care a avut o îmbunătățire de aproape 2,5 ori față de metodele standard în capturarea ADN-ului gram-pozitiv și a redus timpul de așteptare de la 16 ore la 30 de minute.
Cercetătorii sunt optimiști că metoda va îmbunătăți monitorizarea și prevenirea focarelor prin includerea laboratoarelor locale de sănătate publică mai mici.
„Motivul pentru care suntem atât de entuziasmați în legătură cu aceasta este că a fost dezvoltată având în vedere impactul în lumea reală”, a spus Whitehead. „Având acea colaborare cu FDA, fiind capabili să obținem răspunsurile și inputurile lor cu privire la ceea ce trebuie să vedem, ne-a permis să dezvoltăm o metodă care poate fi utilizată și care nu are unele dintre limitările pe care le întâlnești uneori în trecerea de la cercetarea academică la cercetarea translatională.”
