„`html
Proteomica la nivel de celulă unică: Diversitatea proteomului și biologia noncanonicală
În acest interviu, se discută despre progresele în domeniul proteomicii la nivel de celulă unică, evidențiind modul în care spectrometria de masă de înaltă capacitate dezvăluie diversitatea proteomului, reglementarea celulară și secvențele proteice noncanonice.
Numele meu este Nikolai Slavov. Sunt profesor distins COE în Bioinginerie la Universitatea Northeastern, unde sunt și director al Centrului de Proteomica la Nivel de Celulă Unică. De asemenea, sunt director fondator al Institutului Parallel Squared Technology. Cercetarea mea se concentrează pe dezvoltarea tehnologiilor pentru măsurarea proteinelor în celule individuale și utilizarea acestor măsurători pentru a înțelege reglementarea biologică și diversitatea proteomului.
Proteomica este extrem de complexă, iar timp de multă vreme a fost dificil de studiat multitudinea de modificări și interacțiuni proteice. Cu toate acestea, noile tehnologii fac acest domeniu din ce în ce mai accesibil. În funcție de metodă, putem acum pregăti de la sute la zeci de mii de celule unice pe zi. Prin abordări foarte paralele, putem analiza mii de celule unice și, în funcție de instrument și dimensiunea celulelor, putem cuantifica de la sute la multe mii de proteine și modificări.
Această evoluție este deosebit de importantă deoarece nu măsurăm pur și simplu proteinele în masă. Putem studia modificările, transportul, sinteza și degradarea proteinelor cu o acuratețe cantitativă și un debit din ce în ce mai mare. Aceste măsurători încep să dezvăluie biologia care nu poate fi observată prin medierea între populațiile de celule.
Am dezvoltat multiple generații de tehnologii pentru pregătirea probelor. Cea mai recentă abordare pe care o folosim cel mai frecvent efectuează pregătirea probelor pe plăci de sticlă, în picături individuale. Fiecare picătură servește ca un vas de reacție în care o celulă unică este izolată, etichetată și procesată pentru analiză.
Metoda este foarte automatizată, ceea ce ne permite să minimizăm pierderile de probă și contaminarea. Acest lucru este deosebit de important atunci când lucrăm cu celule unice, deoarece cantitatea de material este extrem de mică. Obiectivul este să păstrăm cât mai mult material posibil și să procesăm multe celule într-un mod consistent înainte de analiza prin spectrometrie de masă.
Suntem foarte entuziasmați de posibilitatea de a crea regimuri de multiplexare care să crească debitul fără a reduce adâncimea de acoperire sau acuratețea cantitativă. Am dezvoltat reagenți nu doar pentru a crește numărul de celule care pot fi multiplexate, ci și pentru a crește încrederea în identificarea secvențelor și a permite descoperirea modificărilor peptidice.
Un exemplu este PSMtag pentru plexDIA. Etichetarea peptidelor ne permite să identificăm mai mulți ioni fragmentați în comparație cu peptidele fără etichete. Acest lucru crește încrederea în identificarea secvențelor și sensibilitatea. De asemenea, permite multiplexarea și analiza mai multor probe simultan.
Într-o implementare cu un setup cu două coloane și reagenți PSM în nouă plexuri, am reușit să analizăm bine peste o mie de probe de dimensiunea celulelor unice pe zi, fără a reduce semnificativ adâncimea de acoperire obținută prin controlul corespunzător fără etichete în condiții similare.
Am început, de asemenea, să multiplexăm în domeniul timpului prin suprapunerea gradientelor de elutie ale mai multor probe. Deoarece dimensiunea timpului este ortogonală dimensiunii masei, aceste abordări sunt foarte complementare. Atunci când combinăm multiplexarea în ambele domenii, numărul de celule unice sau puncte de date analizate pe zi poate crește rapid.
Desigur, există provocări asociate cu densitatea foarte mare a punctelor de date, în special interferențele și acuratețea cantitativă. De aceea, metodele computaționale sunt atât de importante. În acest context, am dezvoltat metode precum JMod, o abordare software open-source din Institutul Parallel Squared Technology, pentru interpretarea acestor experimente foarte paralele și foarte multiplexate.
În experimentele de referință, JMod a menținut cuantificarea precisă pe o gamă dinamică de 32 de ori, cuantificând peste 700.000 de precursori într-o singură rundă de spectrometrie de masă.
Am folosit experimente de pulsație metabolică la șoareci, hrănindu-i cu alimente ce conțin izotopi grei și combinându-le cu măsurători multiplexate pentru a determina ratele de sinteză și degradare a proteinelor. De asemenea, am analizat transcriptomul, iar ambele abordări au putut defini independent diferitele tipuri de celule.
Mai important, măsurătorile prin spectrometrie de masă ne-au permis să măsurăm ratele de sinteză și degradare a proteinelor. Deoarece histonele nu sunt eliminate sau degradate într-o măsură semnificativă pe parcursul experimentului, am putut folosi formele lor grele și ușoare pentru a determina de câte ori o celulă individuală s-a divizat.
Celulele care nu s-au divizat conțineau aproape exclusiv histone ușoare, în timp ce celulele care s-au divizat prezentau o proporție mai mare de histone grele. Acest lucru ne-a permis să cuantificăm ratele de proliferare în diferite tipuri de celule la șoareci.
Măsurătorile au subliniat, de asemenea, importanța eliminării proteinelor; rata de eliminare și degradare a proteinelor explica aproximativ 50% din variația totală a abundenței proteinelor. Această contribuție a scăzut mai rapid în celulele cu rate de creștere mai mari, deoarece proteinele pot fi eliminate și prin diluare.
Observăm o variație foarte puternică a abundenței proteinelor între celulele unice din același tip celular. Această variație poate fi destul de distinctă și nu este neapărat prezisă de transcriptom.
Când am examinat corelațiile pereche între proteine în interiorul celulelor, corelațiile proteice au fost mult mai puternice și mai coordonate de grupuri funcționale decât corelațiile corespunzătoare ale ARN-ului. Acest lucru se datorează atât sintezei și degradării proteice reglementate (pe care le-am măsurat direct), cât și fiabilității mai mari a măsurărilor proteinelor, deoarece MS măsoară numere mai mari de copii pentru proteine în celule individuale.
Degradarea proteinelor joacă un rol major: cu cât o proteină este reglementată mai puternic prin degradare, cu atât corelațiile sale pot diferi mai mult de cele ale transcrierilor corespunzătoare.
Am analizat celulele mononucleare din sângele periferic într-un mod asociat, folosind secvențierea ARN a celulelor unice sensibile și proteomica la nivel de celulă unică utilizând un instrument timsTOF. Am putut identifica tipurile de celule din ambele modalități.
Ceea ce a fost deosebit de interesant a fost că am putut identifica și cuantifica un număr mai mare de produse genice la nivel de proteină decât la nivel de ARN în celule individuale. Am obținut o adâncime mai mare, cu mai multe proteine cuantificate în celule unice decât transcrieri, iar datele despre proteine aveau, de asemenea, o completitudine mult mai mare. Cu alte cuvinte, proteinele cuantificate într-o celulă unică erau mai susceptibile de a fi cuantificate în alte celule unice.
